Программа курса "Молекулярная биология"

Часть 1. Структура и функции нуклеиновых кислот

Лектор - академик РАН В.А. Гвоздев

1. История доказательства генетической функции ДНК. Опыты Эвери, Херши и Чейз. Физические свойства молекулы ДНК. Конформационные формы ДНК A, В, и Z, их физические параметры. Неканоническая H-форма ДНК.
2. Кольцевые молекулы ДНК и понятие о сверхспирализации ДНК. Топоизомеры ДНК. Механизмы действия топоизомераз. ДНК-гираза бактерий.
3. Полимеразы, участвующие в репликации у бактерий, характеристика их ферментативных активностей. Точность воспроизведения ДНК. Полимеразы I, II и III E.coli. Субъединицы полимеразы III. Понятие о процессивности ДНК-полимераз.
4. Полимеразы ('мутазы'), обеспечивающие неточное воспроизведение ДНК.
5. Вилка репликации, 'ведущая' и 'отстающая' нити при репликации. Фрагменты Оказаки. Координация синтеза ДНК на комплементарных нитях. Комплекс белков в репликационной вилке.
6. Регуляция инициации репликации у E.соli. Структура участка старта репликации (origin, ori). Репликатор. Понятие о репликоне.
7. Репликативные ДНК-полимеразы эукариот. Праймаза-ДНК-полимераза. Фрагменты Оказаки и особенности их 'процессинга'. Pепликоны эукариот, изменчивость их размеров. Старты репликации (оri) у дрожжей, их структурно-функциональная организация. Изменчивость сайтов ori у многоклеточных эукариот.
8. Молекулярные механизмы, координирующие клеточный цикл и репликацию ДНК. Понятие о 'сверочных точках' (checkpoints). Циклины и протеинкиназы. Молекулярные механизмы, препятствующие новой инициации репликации до завершения клеточного цикла.
9. Проблема репликации линейного незамкнутого фрагмента ДНК. Теломера и теломерные повторы. Теломераза, ее РНК-компонент. Теория старения в связи с динамикой структуры теломеры. Регуляция длины теломеры. Теломерная петля.
10. Классификация типов репарации. Прямая репарация тиминовых димеров и метилированного гуанина. Вырезание оснований. Гликозилазы. Вырезание (эксцизия) поврежденных нуклеотидов. Комплекс ферментов, осуществляющих эксцизионную репарацию.
11. Механизм репарации неспаренных нуклеотидов (mismatch репарация). Выбор репарируемой нити ДНК.
12. SOS-репарация. Свойства ДНК-полимераз, участвующих в SOS-репарации (ДНК-мутазы) у прокариот и эукариот. Представление об 'адаптивных мутациях' у бактерий.
13. Репарация двухнитевых разрывов: гомологичная пострепликативная рекомбинация и объединение негомологичных концов молекулы ДНК.
14. Двухнитевые разрывы ДНК, инициирующие рекомбинацию. Роль рекомбинации в пострепликативной репарации двухнитевых разрывов. Структура Холлидея в модели рекомбинации. Миграция ветви, гетеродуплексы, 'разрешение' структуры Холлидея.
15. Энзимология общей (гомологичной) рекомбинации у E.coli. RecBCD комплекс. RecA белок. Пресинаптическая нить, параметры ее молекулярной структуры. Обмен нитей ДНК при синапсе. Ферменты, участвующие в миграции ветви и разрешении структуры Холлидея. Ортологи RecA белка у эукариот.
16. Различия молекулярных механизмов общей (гомологичной) и сайт-специфичной рекомбинации. Типы хромосомных перестроек, осуществляемых при сайт-специфичной рекомбинации. Регуляторная роль сайт-специфичной рекомбинации у бактерий.
17. IS-последовательности бактерий, их структура. Транспозоны бактерий (Tn3, Tn5, Tn9 и Tn10). Нерепликативный и репликативный механизмы транспозиции. Резольваза и ее функции при репликативной транспозиции.
18. ДНК-транспозоны у эукариот. Двухкомпонентная система ДНК-транспозонов: автономный и дефектный транспозоны. Транспозоны кукурузы и дрозофилы. Влияние транспозонов на активность генов.
19. Классификация ретроэлементов. Различие механизмов перемещения элементов с длинными концевыми повторами (ретротранспозонов и ретровирусов) и LINE-элементов. Ретрогены, или 'процессированные гены', и псевдогены.
20. РНК-полимераза прокариот, ее субъединичная и трехмерная структуры. Разнообразие сигма-факторов. Промотор генов прокариот, его структурные элементы.
21. Стадии транскрипционного цикла. Инициация, образование 'открытого комплекса', элонгация и терминация транскрипции. Сверхспирализация и транскрипция.
22. Аттенюация транскрипции у прокариот. Регуляция экспрессии триптофанового оперона. 'Рибопереключатели'. Механизмы терминации транскрипции.
23. Лактозный оперон. CAP-белок. Регуляция транскрипции в развитии фага лямбда. Принципы узнавания ДНК регуляторными белками (САР-белок и репрессор фага лямбда).
24. Как регулируется образование репрессора фага лямбда? Принципы кооперативности и автогенной регуляции на примере регуляции экспрессии репрессора фага лямбда.
25. РНК-полимеразы эукариот I, II и III. Участие разных полимераз в транскрипции разных клеточных РНК.
26. Регуляция транскрипции полимеразы II. Понятие о цис- и транс-регуляции транскрипции. Регуляторные области промоторов полимеразы II у эукариот. Базальная транскрипция и ее факторы. ТBP и TAF факторы. Роль фосфорилирования РНК-полимеразы II.
27. Белки - активаторы транскрипции, их доменные структуры. Типы доменов, узнающих регуляторные цис-действующие элементы.
28. Комбинаторный принцип в регуляции транскрипции. Коактиваторы и корепрессоры. Энхансеры и энхансеосома. Принцип 'дальнодействия' в регуляции транскрипции.
29. Гомеодомены регуляторных белков и явление гомейозиса. Комбинаторные механизмы, обеспечивающие специфичность взаимодействий гомеодоменов с регуляторными модулями ДНК. Транскрипционные факторы как морфогены в развитии многоклеточных организмов.
30. Внешние сигналы (митогенные факторы, гормоны), регулирующие транскрипцию генов. Примеры систем передачи сигналов. Семейства белков Jun и Fos, кодируемых протоонкогенами. STAT белки. AP1 и CRE сайты в промоторах генов. Белки-коактиваторы семейства р300/CBP.
31. Ядерные рецепторы гормонов, их домены, особенности узнавания ими регуляторных последователностей ДНК. Глюкокортикоидный и тиреоидный рецепторы.
32. Нуклеосома как единица структурной организация хроматина. Октамер гистонов в составе нуклеосомы. Линкер и линкерные гистоны. Нуклеосомы и транскрипция. 'Трансляционное' и 'ротационное' позиционирование ДНК на гистоновой глобуле.
33. Химические модификации гистонов. Понятие о 'гистоновом коде'. АТР-зависимоe "ремоделированиe" хроматина.
34. Кэпирование, сплайсинг и полиаденилирование транскриптов, синтезируемых полимеразой II. Сопряжение транскрипции, сплайсинга и транспорта РНК из ядра в цитоплазму.
35. Механизмы сплайсинга. Роль малых ядерных РНК и белковых факторов. Сплайсосома.
36. Альтернативный сплайсинг, примеры. Транс-сплайсинг. 'Самосплайсинг' у про- и эукариот.
37. Рибозимы. РНКаза Р как рибозим. Интроны групп 1 и 2. Интроны группы 1 как рибозимы.
38. Редактирование РНК. Типы редактирования.

2007 г.

Часть II. Мир РНК и биосинтез белков

Лектор - академик РАН А.С.Спирин

1. Центральная догма молекулярной биологии и генетический код. Принцип комплементарности в структуре ДНК, ее редупликации и ее транскрипции. Поток генетической информации ДНК - РНК - белок. Информационная (кодирующая) РНК, или мРНК. История расшифровки генетического кода. Основные свойства кода: триплетность, код без запятых, вырожденность. Особенности кодового словаря, семьи кодонов, смысловые и 'бессмысленные' кодоны. Некодирующие РНК: открытие, основные виды (рибосомные РНК, тРНК). Малые некодирующие РНК. Современный мир РНК.
2. Основные принципы структуры РНК. Первичная структура. Модифицированные основания. Одноцепочечность. Вторичная структура: формирование коротких двойных спиралей за счет взаимодействия смежных участков внутри цепи. А-форма двойной спирали РНК. Принцип комплементарности и отклонения от него. 'Дефекты' коротких двойных спиралей и отклонения от двуспиральной структуры. 'Тетралупы'. Псевдоузлы. Тройные взаимодействия. Третичная структура: компактное сворачивание полирибонуклеотидной цепи, дальние комплементарные взаимодействия, спираль-спиральные взаимодействия, формирование крупных доменов. Структура тРНК. Структура рибосомных РНК.
3. Генетические и негенетические функции РНК. Комплементарное воспроизведение первичной структуры в реакциях репликации и обратной транскрипции. Кодирование первичной структуры полипептидов (белков). Пространственное структурообразование. Функции специфического узнавания и связывания лигандов. Каталитические функции.
4. Древний мир РНК и происхождение жизни. Гипотеза А.И. Опарина о первичном возникновении белков и ее основной недостаток. Гипотеза о первичном возникновении мира РНК. Элонгация и компартментализация РНК; колонии РНК. Циклы амплификации и селекции РНК. Коммунальный характер мира РНК. Гипотеза К. Вуза (C. Woese) о коммунальном универсальном предшественнике живых существ. Возникновение биосинтеза белка на базе мира РНК. Происхождение ДНК из РНК и закрепление универсального генетического кода. Происхождение трех основных ветвей живых существ их мира РНК.
5. Структура рибосом. Локализация рибосом в клетке. Прокариотический и эукариотический типы рибосом; 70S и 80S рибосомы. Морфология рибосом. Подразделение на субчастицы (субъединицы); диссоциация. Тонкая морфология субчастиц. Рибосомные белки, разнообразие, разделение, номенклатура, особенности структуры. Разборка ('раздевание') субчастиц; кооперативный характер диссоциации белков. Самосборка, ее последовательные этапы, независимое формирование РНП-доменов. Разворачивание субчастиц; ступенчатый характер разворачивания. Периферийное расположение белков на компактных ядрах РНК. Идентификация рибосомных белков на поверхности рибосомы методом иммунной электронной микроскопии. РНК-РНК-контакты при ассоциации рибосомных субчастиц. Рентгеноструктурный анализ рибосомных субчастиц и полных 70S рибосом.
6. Активация аминокислот и образование аминоацил-тРНК. Химические реакции, приводящие к образованию пептидной связи в процессе биосинтеза белка. Активация аминокислоты в реакции с АТФ; образование аминоациладенилата. Перенос аминоацильного остатка на тРНК. Аминоацил-тРНК-синтетазы. Активные центры синтетаз и их специфичность. Принцип 'реактивности половины центров' при функционировании синтетаз. Два класса аминоацил-тРНК-синтетаз, их структурные и функциональные различия. Участки взаимодействия молекул тРНК с аминоацил-тРНК-синтетазами; различия двух классов.
7. Эпицикл трансляции и рабочий элонгационный цикл. Эпицикл трансляции: инициация, элонгация и терминация. Полирибосома. Сопряженная транскрипция-трансляция у прокариот. Рабочий элонгационный цикл рибосомы; три основные этапа цикла. Парциальные функции рибосомы в ходя трансляции. Локализация функциональных центров рибосомы. А, Р и Е участки связывания тРНК. Полярность считывания матрицы (мРНК) в ходе трансляции.
8. Бесклеточные системы биосинтеза белка. История бесклеточных систем. Системы трансляции, сопряженной транскрипции-трансляции и совмещенной транскрипции-трансляции. Прокариотические и эукариотические системы. Основные компоненты систем. 'Грубые' и 'чистые' системы. Системы непрерывного действия (проточные, обменные).
9. Кодон-зависимое связывание аминоацил-тРНК в элонгационном цикле. Адапторная гипотеза Ф. Крика (1955) и ее экспериментальное доказательство (1962 - 1963). Кодон-антикодоновое взаимодействие. Гипотеза Ф. Крика о неоднозначном взаимодействии первого положения антикодона с третьим положением кодона (1966). Характер вырожденности генетического кода как основная фактическая предпосылка гипотезы. Физические предпосылки гипотезы. Таблица взаимодействий первого положения антикодона. Особенности митохондриального кода и взаимодействий первого положения антикодона. Отклонения от универсальности генетического кода в митохондриях и у некоторых бактерий и простейших эукариот. Участие фактора элонгации EF1 (EF-Tu) в связывании аминоацил-тРНК с рибосомой. Структура EF1 (EF-Tu), его взаимодействия с ГТФ и ГДФ и его структурные переходы ('закрытая' и 'открытая' конформации). Связывание аминоацил-тРНК комплексом EF1 (EF-Tu) с ГТФ, образование тройственного комплекса. EF1 (EF-Tu) как катализатор этапа связывания аминоацил-тРНК. Нерасщепляемые и медленно расщепляемые аналоги ГТФ; их эффект на этап связывания аминоацил-тРНК с рибосомой. Роль гидролиза ГТФ в процессе связывания. Фактор элонгации EF1В (EF-Ts), его функция, последовательность реакций с его участием. Антибиотики, воздействующие на этап кодон-зависимого связывания аминоацил-тРНК с рибосомой. Аминогликозидые антибиотики (стрептомицин, неомицин, канамицин, гентамицин и др.), механизм их действия. Тетрациклины как ингибиторы связывания аминоацил-тРНК с рибосомой. Механизмы устойчивости к тетрациклинам.
10. Ложное кодирование и сдвиги рамки считывания на этапе кодон-зависимого связывания аминоацил-тРНК с рибосомой. Трансляция полиуридиловой кислоты, ложное включение аминокислот в полифенилаланиновую цепь. Прочитывание 'бессмысленных' (терминирующих) кодонов. Основные закономерности ложного кодирования. Кинетические основы ложного кодирования. Кинетическая коррекция ('редактирование') ложного кодирования. Факторы, стимулирующие ложное кодирование. Сдвиг рамки считывания: +1 и -1 сдвиги. Последствия сдвига. Сдвиг рамки при синтезе антизима орнитин-декарбоксилазы.
11. Особенности кодирования и включения селеноцистеина в полипептидную цепь белка в процессе элонгации. Образование селеноцистеинил-тРНК из серил-тРНК. Связывание селеноцистеинил-тРНК терминирующим кодоном UGA. Необходимость специального структурного элемента - специальной 'шпильки' на мРНК вслед за UGA у прокариот или специальной структуры в 3'-нетранслируемой области мРНК у эукариот. Участие специального фактора элонгации SELB - аналога и гомолога EF1 (EF-Tu).
12. Транспептидация. Химия реакции. Пептидил-трансферазный центр большой рибосомной субчастицы; рибозимный катализ. Тетраэдрический интермедиат реакции транспептидации, стереохимия его образования и распада. Ингибиторы транспептидации: хлорамфеникол, линкомицин, амицетин, стрептограмины, анизомицин. Механизм действия пуромицина.
13. Транслокация. Определение транслокации, физические события транслокации, экспериментальные тесты. Участие фактора элонгации EF2 (EF-G) c ГТФ. Доменная структура EF-G; особенности домена IV. 'Молекулярная мимикрия' (сходство EF-G с комплексом EF-Tu:Aa-tRNA. 'Энзиматическая' и 'неэнзиматическая' (бесфакторная) транслокация. Основные следствия открытия бесфакторной транслокации: транслокация как свойство рибосомы, термодинамическая спонтанность транслокации, каталитическая функция EF-G, зависимость конформационного катализа от ГТФ. Ингибиторы транслокации: фусидовая кислота, виомицин, их механизмы действия.
14. Ошибки транслокации. 'Непотриплетная' транслокация: проскальзывание по гомополимерному участку мРНК, соскальзывание на смежный триплет, 'прыжок' через несколько нуклеотидов мРНК. Транслокационный сдвиг рамки. Соскальзывание и сдвиг рамки при трансляции RF2-мРНК. 'Прыжок' при трансляции мРНК гена топоизомеразы фага Т4. 'Прыжок' с домена тРНК на домен мРНК в случае тмРНК ('транс-трансляция').
15. Рибосома как молекулярная машина. Транслокация как проявление транспортной функции рибосомы. Крупноблочная подвижность рибосомы. Принцип смыкания - размыкания. Первые экспериментальные доказательства подвижности этого типа в рибосоме при транслокации (малоугловое нейтронное рассеяние). Подвижность доменов малой субчастицы рибосомы при кодон-зависимом связывании аминоацил-тРНК (рентгеноструктурный анализ). Подвижность в большой субъединице и межсубъединичные сдвиги при связывании аминоацил-тРНК и транслокации. Особенности молекулярных машин; тепловые движения как движущая сила. Отбор движений ('демон Максвелла') в молекулярных машинах. Роль связывания ГТФ и его гидролиза в отборе движений. Полный рабочий цикл рибосомы как молекулярной машины.
16. Инициация трансляции. Функциональное назначение инициации трансляции. Участники процесса инициации. Основные этапы процесса инициации. Инициация трансляции у прокариот: факторы инициации, инициаторные кодоны, 3'-конец РНК малой рибосомной субчастицы и последовательность Шайна- Дальгарно в мРНК; 'сила' мРНК. Независимая инициация и трансляционное сопряжение (индуцированная инициация и скольжение-реинициация) на полицистронных мРНК прокариот. Инициация трансляции у эукариот: факторы инициации, инициаторные кодоны, 5'-нетранслируемая область и кэп-зависимая 'концевая' инициация. Сканирование 5'-нетранслируемой области. Возможность шунтирования участков 5'-нетранслируемой области при сканировании (РНК мозаики цветной капусты). 'Внутренняя' кэп-независимая инициация у эукариот. Последовательность событий эукариотической инициации; 43S и 48S инициаторные комплексы рибосомы. Цикл инициаторных факторов eIF2:GDP/GTP и eIF2B. 3'-концевые усилители инициации трансляции у эукариот; роль полиаденилового 'хвоста' мРНК; циркуляризация эукариотических полирибосом. Инициация с помощью аминоацилированного тРНК-подобного 'хвоста' (РНК желтой мозаики турнепса). 'Внутренняя' инициация без факторов инициации (РНК вируса паралича сверчка).
17. Регуляция трансляции у прокариот. Трансляционная репрессия. Регуляция синтеза рибосомных белков. Ауторегуляция синтеза треонил-тРНК-синтетазы. Регуляция трансляции РНК бактериофага MS-2. Трансляционная регуляция антисмысловыми РНК. 'Рибопереключатели' - аптамерные модули 5'-нетранслируемых областей мРНК как регуляторы трансляции.
18. Регуляция трансляции у эукариот. Особая роль регуляции на уровне трансляции у эукариот. Тотальная регуляции трансляции путем фосфорилирования фактора инициации eIF2 (гем-регулируемая фосфокиназа, дсРНК-регулируемая фосфокиназа, тРНК-регулируемая киназа, стресс-регулируемая киназа). Механизм тотального подавления трансляции при фосфорилировании eIF2. Регуляция инициации короткими рамками считывания, предшествующими основной кодирующей последовательности мРНК. Трансляционная репрессия индивидуальных мРНК. Трансляционная регуляция синтеза ферритина. Регуляция трансляции с помощью микроРНК: деградационный механизм через комплементарное связывание с кодирующей областью мРНК ('РНК-интерференция'); механизм подавления трансляции через воздействие на 3'-нетранслируемую область.
19. Маскирование - демаскирование мРНК в процессах оогенеза, сперматогенеза и клеточной дифференцировки. Маскирование мРНК, ее особенности. Маскированные рибонуклеопротеидные частицы (информосомы). Основные белки информосом и их роль в переходах из маскированного состояния в активное и обратно. Роль специальных последовательностей ('маскирующих элементов') 3'-нетранслируемой области и их узнающих белков (первичных 'маскирующих' белков). Маскирование мРНК в оогенезе Spisula solidissima и ее демаскирование после оплодотворения. Маскирование fem-3 мРНК Caenorhabditis elegans при переходе из личиночной стадии самца во взрослую стадию самки (смена сперматогенеза на оогенез). Маскирование и демаскирование мРНК в оогенезе и раннем эмбриогенезе лягушки; роль белков, контролирующих полиаденилирование и блокирующих инициацию трансляции. Маскирование и демаскирование мРНК липоксигеназы в процессе эритропоэза млекопитающих. Маскирование и демаскирование мРНК антериоральных (bicoid, hunchback) и постериоральных (nanos) детерминант яйца дрозофилы в оогенезе и после оплодотворения: демаскирование nanos мРНК путем 'заякоривания' в заднем отделе яйца и установление задне-переднего градиента Nos-белка, являющегося маскирующим белком hunchback мРНК; детерминация передне-задней оси эмбриона. Наличие сигналов внутриклеточного транспорта и локализации в 3'-нетранслируемой области мРНК. Конденсация и олигомеризация мРНП (информосом) как заключительная фаза маскирования.
20. Регуляция скорости элонгации. Время элонгации полипептидной цепи на рибосоме; экспериментальное определение 'транзитного времени'. Профиль распределения полирибосом как отражение соотношения скоростей инициации и элонгации. Неравномерность скорости элонгации; трансляционные паузы. Минорные синонимные тРНК и редкие кодоны; паузы на редких ('модулирующих') кодонах мРНК. Структурные барьеры вдоль цепи мРНК как возможная причина трансляционных пауз. Ингибиторные аминокислотные последовательности растущих полипептидов.
21. Терминация трансляции. Терминирующие кодоны. Белковые факторы терминации прокариот и эукариот; два класса факторов терминации. Узнавание терминирующего кодона фактором терминации 1-го класса в А-участке рибосомы. Схема доменной структуры фактора терминации 1-го класса. Индукция гидролиза сложноэфирной связи пептидил-тРНК в пептидил-трансферазном центре. Эвакуация деацилированной тРНК из Р-участка и факторов терминации из А-участка с участием факторов терминации 2-го класса и ГТФ/ГДФ. Фактор освобождения рибосом (RRF, RF4) прокариот.
22. Альтернативные пути новосинтезированного полипептида. Котрансляционное сворачивание в компактную глобулу. Экспериментальные подходы к изучению котрансляционного сворачивания. Взаимодействие недосвернутого или неправильно свернутого белка с шаперонами. Шапероны и шаперонины прокариот и эукариот - основные типы. Трансмембранная транслокация растущего пептида. Сигнальный пептид. Сигнал-узнающая частица (SRP), ее нуклеопротеидная природа. Взаимодействие сигнал-узнающей частицы с сигнальным пептидом, остановка трансляции, взаимодействие с сигнальным рецептором мембраны эндоплазматического ретикулума. Транслокационный (полипептид-проводящий) канал мембраны эндоплазматического ретикулума - схема строения. Котрансляционное прохождение растущего пептида через канал; латеральные ворота канала; трансмембранное встраивание синтезируемого белка в мембрану эндоплазматического ретикулума.. Котрансляционное встраивание синтезируемого белка в плазматическую мембрану бактерий. Пост-трансляционная трансмембранная транслокация белков у бактерий.

2008 г.

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 02.05.2010