Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://chem.msu.ru/rus/vmgu/984/233.pdf Дата изменения: Tue Sep 12 01:28:38 2000 Дата индексирования: Sun Apr 10 12:40:59 2016 Кодировка: Windows-1251 Поисковые слова: глобулы

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 1998. Т. 39. ? 4

233

ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ УДК 577.15.024.У

СТАБИЛИЗАЦИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ИОНАМИ МАГНИЯ
О.М. Полторак, Е.С. Чухрай, И.Ю. Торшин, С. Наккар, М.Н. Веселова (кафедра физической химии)

Показано на примере щелочной фосфатазы, иммобилизованной на поверхности силикагеля, модифицированного хол е стерином, что прису т ствие иона магния в контактном растворе стабилизирует нативный димер фермента, а разрушение координационной сферы магния и вымывание последнего во внешнюю среду (хранение образца в отсутствие ионов магния) приводит к возникновению лабильного легко диссоциируемого димера, крайне неустойчивого при хранении в среде, лишенной магния. Анализ структуры межбелкового контакта щелочной фо сфатазы E. coli по данным Р СА [1] показал соответствие между минимальным числом стадий в кинетиче ском механизме термоинактивации и числом конт а ктных участков между глобулами димера, равным трем [2]. В этой работе показано, что третичная структура фермент а стабилизирована межбелковым взаимодействием глобул димера, выделены два узловых аминокислотных остатка Glu 410 и Gln 416, оказывающие, вероятно, наибольшее влияние на термостабильность. Разрушение всех связей любого из этих аминокислотных о ст атков приводит к сильному изменению конформации петли 402-417, несущей каталитически активный His 412, и к полной потере каталитиче ской активно сти фермент а. Таким образом, работ а [2] предлагает структурное обоснование потери каталитической активности в результате диссоциации димера щелочной фос фатазы на протомеры согласно (1) Е
2, стаб

пло ско сть, параллельна большой -структуре, содержит спираль 333-359 и петлю-спираль 288-298-312. Чере з линию двугранного у гла проходит пло ско сть петли 1-29 ( пло ско сть III межбелково го конт акт а). Расстояние между С- и N-концами полипептидной цепи со ст авляет 30 Е. Оба конца расположены в передней части глобулы, причем С-конец расположен со стороны межбелкового конт акт а. Ближе к о снованию клина в задней его части расположена малая -структура, в передней отрезки полипептидной цепи 234264 и 160-200. Большая -ст руктура перпендикулярна пло ско сти межбелкового контакта. Основания 'клиньев' глобул направлены в противоположные стороны.

Е2 Е

2, лаб

= 2Е 1 2Ед .

(1)

В схеме (1) последовательно показаны нативный стабильный димер, стабилизированный тремя межсубъединичными контактами, интермедиат, стабилизированный двумя конт актами, лабильный димер, ст абилизированный лишь одним контактом, влияющим на положение His 412, неактивный протомер и денатурированный протомер; k1, k-1 и k д соответствующие константы скорости диссоциации и ассоциации лабильного димера и денатурации протомера. Согласно работе [3], каждая глобула имеет клиновидную форм у. Две из наклонных поверхно стей пло с ко сти меж белковог о конт а к т а I и II (в т орая

Рис. 1. Кинетика термоинактивации щелочной фосфатазы, адсорбированной на SiO 2+хол, при 23њ в 0.05 М трис-буфере в присутствии 0.03М MgCl2 при разных значениях рН: 1 7.2, 2 7.6, 3 8.0, 4 8.7, 5 9.2, 6 9.5 (v0 = 25.5.10 4 OE/мин.мкг белка)


234

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 1998. Т. 39. ? 4

Рис. 2. Кинетика термоинактивации иммобилизованной щелочной фосфатазы в отсутствие ионов магния при рН: 1 7.2, 2 7.6, 3 8.0, 4 8.7, 5 9.2, 6 9.5 (v0 = 25.5.104 OE/мин.мкг белка)

ствии (рис. 1) и в отсутствие (рис. 2, 3) ионов магния в контактном растворе. Иммобилизованная щелочная фо с ф ат аза в эт ом эксперименте была удобным объектом исследования, по скольку в т аком виде (монослой фермента на гидрофобном носителе) она устойчива к бактериальному заражению. Эксперименты можно проводить на одном и том же образце длительно е время при 23њ. Опыт длился 40 дней, однако в присутствии ионов магния фермент потерял чуть более 50% активно сти, тогда как в от сут ствие ионов магния в конт актном растворе активно сть упала более чем на 80%. На кинетических кривых рис.1, полученных в присутствии 0.03М MgCl 2, имеет место индукционный период, как следствие неизменности активности фермента в течение первых двух суток хранения. Индукционный период отвечает стадии скрытых изменений плавлению конформационного замка. Использование соотношения (2) n = (0.13 + ) / (0.13 - 0.05 ) (2)

В настоящей работе приведены данные термоинактивации щелочной фосфатазы, адсорбированной на силикагеле, модифицированном холе стерином. Методы приготовления носителя, методы адсорбции и определения активности приведены в работе [4]. Для проявления максимальной активности щелочной фосфатазы, приготовленной из кишечника цыпленка ( фирма 'Reanal'), необходимо присутствие в активном цент ре фермента помимо двух каталитически активных атомов цинка ионов магния [1]. Прочность связывания магния в активном центре различна для ферментов, полученных из различных источников. В активном цент ре магний находит ся на расстоянии 5 и 7 Е соответственно от первого и второго атомов цинка. Он не взаимодействует непосредственно с субстратом. Роль магния в активном центре щелочной фосфатазы о ст ает ся неясной, хотя в литературе этому вопро су уделено много внимания. Важная информация получена в работе [5], где проведено сравнение аминокислотных последовательностей в области активного центра с последующим сайт-направленным мутагенезом фермента из E. coli. Ясно одно ионы магния в активном центре щелочной фосфатазы бактериального проис хо ждения св язаны про чнее, чем в щелочной фо с фатазе животного происхождения. Щелочная фо сфат аза жив отного происхождения являет ся удобным объектом изучения стабилизирующей роли магния, пос ко льк у магний легко и обратимо св язывает ся в ее активном центре. На рис. 13 представлены кинетические кривые термоинактивации фермента при хранении в 0.05М т рис-НСl буферном раств оре в присут-

позволяет определить число минимальных стадий в этом процессе. Определение безразмерной величины показано на рис. 1. Кинетические кривые, полученные в интервале рН 7.2 9.5, ложатся на одну кривую. Величина = 0.21, что соответствует n 3. Это согласует ся со схемой (1), предполагающей т ри активных димерных интермедиата, отличающихся стабильностью и образованных с помощью одного, двух и трех межглобулярных контактов. Константа скоро сти локальной диссоциации иммобилизованного димера щелочной фо с фат азы k 1 в изученном интервале кон-6 -1 центраций не зависит от рН и равна 1.2.10 c .

Рис. 3. Данные рис. 2, представленные в полулогарифмических координат ах


ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 1998. Т. 39. ? 4

235

На рис. 2 представлены две кинетические кривые термоинактивации щелочной фосфатазы в отсутствие ионов магния: I в интервале рН 7.2 8.7 и II при рН 9.2 и 9.5. На рис. 3 данные представлены в полулогарифмиче ских координатах. На кинетиче ских кривых отсутствует индукционный период. Процесс обнаруживает зависимо сть от рН, начиная с рК 9, что соответствует Gln (рК = 9.13). Эти данные согласуют ся с ре зульт ат ами ст руктурного ана лиза [2], где выделено два узловых аминокислотных остатка Glu 410 и Gln 416, оказывающих наибольшее влияние на термостабильность. На рис. 3 показано, что кинетика термоинактивации двустадийна и соответствует кинетиче скому механизму двустадийной диссоциативной термоинактивации активного лабильного димера (3) Е2 = 2Е1 2Ед . (3)

Отсутствие на кинетических кривых индукционного периода означает, что в системе нет ст абильного димера, стабилизированного тремя межбелковыми контактами, а присутствует лишь лабильный димер с одним межбелковым контактом, который легко и обратимо диссоциирует на неактивные субъединицы. По скольку в эксперименте использована адсорбированная щелочная фосфатаза, то речь идет о локальной диссоциации. Соответствующие данные представлены в т аблице. Значения кинетиче ских констант скоро сти локальной диссоциации показывают, что по следняя увеличивается более чем в 1.5 раза при рН > 9 и превышает соответствующую величину для фермента в присутствии ионов магния в 3.5 раза (для рН 7.2 8.7) и в 5.5 раз (для рН 9.2 9.5). Таким образом, на о снове кинетиче ского ана лиза данных по термоинактивации иммобилизованной щелочной фосфатазы в присутствии и в отсутствие ионов м агния в конт актном растворе можно сделать вывод о стабилизирующей роли магния. Атом магния коор динирован т ремя группами Asp 51, Glu 322 и Thr 155. Из них т о лько Asp 51 нахо дится в б лизи межбелков ого конт акт а (рис. 4), образуемого аминокислотами спирали 54-66, Asp 55, Thr 59, Arg 62 с Gln 416 со с едней глобулы. От ре зо к Asp 51-Asp 55,

Рис. 4. Координация атома магния в молекуле щелочной фо с фатазы. Черточками показаны водородные связи. Водородные связи Hel 54-66 о тно сят ся к межбелковому конт акту

примерно перпендикулярный межбелковому контакту, имеет водородные связи с собственной глобулой только на концах (взаимодействие между атомами N и О главной цепи), и его положение отно сительно глобулы поддерживается, вероятно, атомом магния. По всей видимости, при отсутствии магния спираль 54-66, параллельная плоскости контакта, смещается относительно собственной глобулы под действием со с едней, что и может приводить к медленному разрушению контакта глобул. Настоящая работа поддержана грантом РФФИ 9603-32713а и грантом ИНТАС 93-2577 (Р С-5224), за что авторы выражают свою признательность РФФИ и ИНТАС.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Kim E.E., Wyckoff W.W. // J. Mol. Biol. 1991. 218. P. 449. 2. Полторак О.М., Торшин И.Ю., Чухрай Е.С. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1996. 37. С. 431. 3. Торшин И.Ю., Полторак О.М., Чухрай Е.С. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1996. 37. С. 335. 4. Наккар С., Чухрай Е.С., Веселова М.Н., Полторак О.М. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1989. 30. С. 450. 5. Janaway C.M.L., Xu Xu, Merphy J.E., Caidaroglou A., Kantrowitz E.R. //Biochemistry. 1993. 32. P. 1601.
Поступила в редакцию 05.11.96

Кинетические параметры локальной дисcоциации димера щелочной фосфотазы на SiO2 в отсутствие ионов магния Константа 7.2-8.7 (I) K1ћ10 , c Kдћ10 , c
7 6 -1 -1

Интервалы рН 9.2-9.5 (II) 6.9 3.1

4.3 2.9