Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/FBB/year_02/science_1/themes_2004f/Vyssokikh_3.doc Дата изменения: Wed Dec 1 21:54:48 2004 Дата индексирования: Sat Dec 22 07:30:38 2007 Кодировка: koi8-r Поисковые слова: storm

Отдел биоэнергетики НИИФХБ. Приглашаются студенты 3го курса ФББ для
выполнения курсовых работ.

Предлагается следующая тема работы:
«Исследование диссоциации октамера митохондриальной креатинкиназы в
состоянии переходного комплекса».
Известно, что при индукции аналога переходного комплекса
митохондриальной креатинкиназы (MgADP, KNO3, creatine) происходит изменение
структуры фермента. Однако, в данном случае нитрат-ион имитирует планарную
конфигурацию переносимого между креатином и АТФ фосфорильного остатка,
поэтому при связывании субстратов не происходит изменения конформации
активного центра фермента и движения доменов белковой молекулы. Это
позволяет получать стабильный аналог переходного комплекса и изучать его
свойства. В то же время, существуют данные о том, что олигомер
креатинкиназы, находящейся в активированном состоянии, более устойчив к
воздействию окислителей, таких как пероксинитрит и др. Кроме того,
известно, что митохондриальная креатинкиназа выполняет в этих органеллах,
наряду с энзиматической, структурную функцию. Смещение равновесия в сторону
октамера предотвращает развитие неспецифической проницаемости внутренней
мембраны и изменение формы митохондрий на уровне ультраструктуры. Таким
образом, сравнительный анализ параметров диссоциации активной и неактивной
формы митохондриальной креатинкиназы позволит углубить наши представления
о значении такого распространенного явления в клетке, как сочетание
структурных и энзиматических функций олигомеров ферментов (ГАФД, миокиназа
и др).
Студенту будет предложено выполнить исследование диссоциации
выделенного октамера митохондриальной креатинкиназы в буферном растворе и в
присутствии индукторов формирования аналога переходного комплекса. Для
этого студент будет обучен выделению фермента из митохондрий сердца крысы
(получение препарата митохондрий методом дифференциального
центрифугирования, характеристика препарата митохондрий методом
полярографии и определения активности креатинкиназы - спктрофотометрически,
измерение концентрации белка методом Горналла и с бицинхониновой кислотой)
- методом осмотического шока в гипотонической среде в присутствии неионного
детергента, далее при помощи двухстадийной хроматографии безмембранного
экстракта митохондрий (анионообменная - FPLC и гель-фильтрация в варианте
HPLC). Для оценки соотношения олигомер/димер при выделении и в эксперименте
по диссоциации полученный препарат фермента будет охарактеризован методом
изоэнзимэлектрофореза, что позволит одновременно определять соотношение
активной/ неактивной форм (по интенсивности окрашивания белковой полосы при
восстановлении тетразолия в формазан в сопряженной с НАД-зависимой
дегидрогеназой системе). Чистота препарата будет оценена электрофоретически
при окрашивании ПААГ серебром или красителем Storm. (В этом месте, если
студент не успеет сделать собственно работу, можно остановиться, поскольку
для учебной работы этого достаточно, а в качестве новизны можно варьировать
детергенты для оптимизации экстракции октамера. Кроме того, недавно нами
получен флюоресцентный ридер "Fluoroscan", что позволит оптимизировать
процедуру определения активности фермента во фракциях - поскольку фермент
явно склонен к адсорбции на пластике, подбор условий корректного
определения активности также может быть элементом новизны работы). Кроме
того, параллельно будет проведено определение соотношения октамер/димер
методом гель-фильтрации в варианте ВЭЖХ. Будет исследована временная,
температурная, рН и солевая зависимости диссоциации/ассоциации для
олигомера митохондриальной креатинкиназы.
Вариантом работы является исследование зависимости параметров диссоциации
для мембран-ассоциированных олигомеров MiaCK в неактивном, активированном
состоянии и в виде аналога переходного комплекса (для студентов, которые
успеют все предыдущее).
В лаборатории имеется все необходимое оборудование и реактивы для
проведения вышеперечисленных опытов, оборудованы рабочие места
полярографиста и для проведения препаративных работ, электрофореза любого
типа, FPLC и HPLC. Студенту будет также обеспечен доступ к сети Интернет и
необходимым базам данных и литературе.

М.Высоких.
"Vyssokikh Mikhail"