Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://plantphys.bio.msu.ru/education/nr.doc Дата изменения: Fri Dec 16 20:14:01 2011 Дата индексирования: Mon Oct 1 19:27:06 2012 Кодировка: koi8-r Поисковые слова: n02

РАБОТА 1. Определение активности НИТРАТРЕДУКТАЗЫ in vivo.

Азот - один из четырех элементов органогенов. Расчеты
показывают, что за год растения земного шара выносят из почвы 1010
т азота (для сравнения, в результате азотфиксации они получают 17,5
* 107 т). Основными доступными растению формами азота являются NO3- и
NH4+. Почвенные нитраты находятся в водной фазе, а ионы NH4+
адсорбируются на отрицательно заряженных почвенных частицах. Поэтому
поглощение аммония осуществляется корнями по мере роста и
проникновения в новые слои почвы, а ионы нитрата движутся к корневой
поверхности с водным током. Соотношение окисленной и восстановленной
форм азота в почве варьирует, но очень часто в силу высокой активности
почвенных нитрофикаторов, особенно на хорошо аэрируемых не очень
кислых почвах, основной доступной растениям формой являются нитраты.
Поступив в растение, нитраты либо восстанавливаются и включаются в
состав органических соединений, либо накапливаются в тканях и служат
запасной формой азота. Ассимиляторное восстановление NO3- включает в
себя два этапа: двухэлектронное восстановление нитрата в нитрит,
катализируемое нитратредуктазой (НР) и шестиэлектронное
восстановление нитрита до аммония, катализируемое нитритредуктазой
(НиР). Скорость второй реакции в 5-20 раз выше, поэтому в норме
нитриты практически не накапливаются в тканях. Аммоний токсичен и
также не накапливается, а быстро включается в первичные реакции
аминирования и амидирования. Реакция, катализируемая НР, самая
медленная в цепи превращений атома азота от окисленного состояния до
положения в составе органических соединений и, следовательно,
именно этот этап лимитирует скорость процесса в целом. Фермент НР
расположен в цитоплазме, представляет собой гомодимер, каждая
мономерная часть включает ФАД, цитохром b557 и молибдоптерин, в
качестве донора электронов использует NAD(P)H. В растительных тканях
нет альтернативных путей восстановления NO3- и NO2- . Поэтому по
активности НР можно судить об интенсивности усвоения нитратного азота.

Ассимиляция нитрата у высших растений идет как в надземных
органах, так и в корнях. В зеленых тканях 2 электрона поступают от
окисления углеводов, а 6 электронов - из ЭТЦ фотосинтеза через
ферредоксин. В корнях все 8 электронов поступают из реакций окисления
углеводов. Распределение нагрузки по усвоению нитрата между корнями
и листьями во многом определяются видом растения. По этому признаку
растения подразделяют на три основные группы:
1. Восстановление нитратов происходит практически полностью в
корнях.
2. Нитратредуктазная активность практически не проявляется в
корнях, ассимиляция нитратов происходит главным образом в
листьях.
3. Активность нитратредуктазы поддерживается и в листьях, и в
корнях (нейтральные растения).

Цель работы. Сравнить потенциальные возможности корней и
листьев 12-дневных проростков пшеницы (Triticum aestivum L.),
выращенных на питательном растворе, ассимилировать NO3-.

Ход работы. Активность НР in vivo (на кусочках тканей)
определяют по количеству эндогенно образовавшегося нитрита, который
накапливается в тканях в темноте, в анаэробных условиях. Растения (15-
20 шт.) достают из раствора и делят на листовые пластинки 1-ого листа,
2-ого листа, корни и так называемые «остатки» (листовые влагалища 1-
ого и 2-ого листа зачатки 3-его листа). Корни 15-20 растений
просушивают фильтровальной бумагой и взвешивают. Рассчитывают среднее
значение сырой массы корней одного растения. Аналогично определяют
среднее значение сырой массы листовых пластинок 1 -ого, 2-ого листа и
«остатков» одного растения.
Органы растения разрезают на кусочки размером около 2-3 мм. Для
каждого органа делают навеску (по 0,5 г) в одной повторности (1
биологическая повторность). Навеску 1-ого, 2-ого листа, «остатков» и
корней помещают в один из 4-х пенициллиновых флаконов, в которые
предварительно наливают 7 мл инкубационной смеси:
5 мл фосфатного буфера (0,6 М, pH 7,4),
1 мл яблочной кислоты (0,1 М),
1 мл нитрата калия (0,1 М).
Флаконы закрывают резиновой пробкой, смазанной по краям
вазелином. С помощью вакуумного насоса через иголку, которой
прокалывают резиновую пробку, откачивают воздух в течение 2-х минут.
При этом наблюдают эффект «закипания» среды с содержимым, и флакончик
охлаждается. Если кусочки ткани выброшены эвакуируемым воздухом в
верхнюю часть флакона, их надо стряхнуть вниз. Затем при работающем
насосе, не удаляя иглу из пробки, через которую откачивают воздух,
отсоединяют вакуумный шланг от иглы. Воздух, таким образом, попадает
во флакон. Хорошо видно, как после инфильтрации ткань темнеет и
опускается на дно. Таким способом увеличивают проницаемость тканей для
среды инкубации; экзогенно добавленные малат и нитрат создают в
клетках оптимальные условия для работы НР.
Для создания анаэробных условий, которые необходимы для предотвращения
конкуренции НР с кислородом за эндогенно образующийся (при окислении
малата до оксалоацетата) восстановленный HADH, воздух из флаконов
вновь эвакуируют в течение 2 минут. Затем их помещают в термостат при
27њС на 45 минут. Образующийся нитрит из инфильтрированной ткани
свободно попадает в омывающий раствор и становится доступным для
количественного определения. По истечении 45 минут флаконы слегка
встряхивают, открывают и кусочки ткани отделяют от среды инкубации
фильтрованием в чистые пенициллиновые флаконы через 1 слой марли. В
полученном фильтрате определяют концентрацию образовавшегося нитрита.
2 мл анализируемого фильтрата (для одной биологической пробы
делают две аналитические повторности) добавляют к 2 мл реактива
Грисса, который готовят в двух пробирках непосредственно перед
определением, смешивая 1 мл а-нафтиламина и 1 мл сульфаниловой
кислоты. Вместе с нитритом они образуют азосоединение, которое
окрашено в розовый цвет. Реакция идет в две стадии: сначала
сульфаниловая кислота, взаимодействуя с HNO2, дает диазосоединение,
которое затем в реакции с а-нафтиламином превращается в конечный
окрашенный продукт.
Отбор проб и реакцию определения N02- следует проводить быстро,
сразу после 45 мин экспозиции, чтобы избежать потерь нитрита. С
реактивом Грисса окраска развивается в течение 10 минут. Интенсивность
окрашивания определяют на ФЭКе при 540 нм (зеленый светофильтр) в 0,5
см кюветах против дистиллированной воды (т.к. D540 контроля на
реактивы = D540 дист. H2O). По калибровочной кривой находят
концентрацию нитритного азота (Y) в фильтрате (мкг N-NO2-/мл):
y=1,523х+0,001, где х=D540.
Рассчитывают активность НР (АНР) в мкмоль N02- на г сырой массы
растительной ткани в час:
Y * 7 мл * 60 мин/ч

АНР= --------------
--------------------------------- ,

14 (атом. вес N) * mнавески (г) * 45
мин

и потенциальную возможность (Р) корней и листьев восстанавливать
нитрат (мкмоль NO2- на орган 1 растения в час):

Р = АНР * масса органа (г).

Оформление работы. Результаты работы записывают в виде таблицы.

Таблица данных по определению усвоения нитрата опытными
растениями.
| | |D540 | | | |
|Орган |Масса| |АНР |P |% |
|опытно|орган| |(мкмольNO|(мкмольN|вклад |
|го |а | |2-/г*час)|O2-/орга|органа|
|растен|(г) | | |н*час) |в общ.|
|ия | | | | |ассим.|
| | | | | |нитрат|
| | | | | |а |
| | |1 |2 |Dср | | | |
|1-ый | | | | | | | |
|лист | | | | | | | |
|2-ой | | | | | | | |
|лист | | | | | | | |
|«остат| | | | | | | |
|ки» | | | | | | | |
|корень| | | | | | | |
| | | | | | | | |
|Целое |_ |_ |_ |_ |_ |( |100% |
|растен| | | | | | | |
|ие | | | | | | | |

По результатам исследования делается вывод о принадлежности пшеницы к
одной из трех групп растений (см. 1 стр.), различающихся
распределением между корнями и листьями нагрузки по усвоению нитрата.

Литература:
«Физиология растений», под редакцией проф. И.П. Ермакова, 2005, с.362-
371.