Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://plantphys.bio.msu.ru/especial/lp_optics.doc Дата изменения: Tue Jun 7 16:07:18 2011 Дата индексирования: Mon Oct 1 19:44:28 2012 Кодировка: koi8-r Поисковые слова: trees

Анализ пиментов в фотосинтезирующих тканях с использованием спектров
отражения и пропускания.

Решение очень многих задач в области физиологии растений требует
характеристики пигментного состава изучаемого объекта. Знания о составе и
соотношении пигментов в фотосинтезирующей ткани позволяют судить о многих
аспектах физиологического состояния растений. В частности, они указывают на
недостаток или избыток освещения, качество и эффективность работы
фотозащитных механизмов. Пигментный состав изменяется при стрессе, болезнях
и старении фотосинтезирующей ткани.
Классический метод определения концентрации пигментов в
фотосинтезирующей ткани связан с экстракцией пигментов из ткани путем
растирания ее с каким-либо органическим растворителем (обычно ацетон,
этанол, метанол), измерением оптической плотности экстракта при различных
длинах волн и расчетом концентраций пигментов по соответствующим формулам.
Благодаря своей точности, быстроте и доступности этот метод в настоящее
время является основным для характеристики пигментного аппарата растений.
Однако решение ряда задач требует наблюдения за изменением пигментного
состава ткани во времени, или быстрого определения пигментного состава
сразу большого числа объектов. Решить эти задачи классическим методом
сложно, т.к. он предполагает разрушение исследуемой ткани. Поэтому в
настоящее время разрабатываются альтернативные - недеструктивные - методы
определения концентрации пигментов в тканях, позволяющие сохранять её
целостность. Одним из таких методов является метод анализа пигментного
состава ткани по спектрам отражения.
Фотосинтезирующая ткань растения - оптическая система, которая сложным
образом взаимодействует с падающим на неё светом. Помимо пигментов,
поглощающих значительную часть квантов в видимой области спектра (400-800
нм), в ней находятся внутриклеточные структуры, способные рассеивать
попавший в ткань свет, тем самым позволяя поглотить ещё больше квантов
света. Благодаря этому зелёная ткань растения способна поглощать до 90%
падающего на неё света. Остальная часть света либо проходит сквозь орган,
либо рассеивается, отражаясь от его поверхности. При изучении оптики листа
принято говорить о таких характеристиках изучаемой ткани, как поглощение
(A), отражение (R) и пропускание (T).
В работах по разработке недеструктивных методов анализа пигментного
состава наибольшее внимание уделяется анализу спектров отражения ткани.
Поскольку пигменты вносят существенный вклад в поглощение в видимой
области, изменение их содержания (вследствие старения или стрессового
воздействия) и, как следствие, изменение окраски (пожелтение, побурение,
хлороз) вызывает изменение спектров отражения ткани. Органы растений,
содержащие большое количество хлорофилла, обладают низким отражением во
всей видимой области. При этом снижение содержания хлорофилла до некоторого
предела (5-10 нмоль/см2) вызывает практически пропорциональное возрастание
отражения в зеленой и ближней ИК-области спектра, где коэффициенты
экстинкции хлорофилла невелики, в то время как в синей (где отражение ниже
еще и за счет поглощения света каротиноидами) и красной области отражение
остается низким или увеличивается очень незначительно. При дальнейшем
снижении содержания хлорофилла отражение в красной области начинает
увеличиваться (Merzlyak et al., 1997, 1999, 2003). При синхронном c
хлорофиллом снижении содержания каротиноидов также повышается отражение в
синей области. Вместе с тем в стареющих тканях часто встречается явление
сохранения каротиноидов, в результате отражение в синей области остается
низким (примером могут служить плоды яблони и желтеющие осенние листья, см.
Merzlyak et al., 1999, 2003). Изменения пигментного состава ткани и
соответствующее изменение спектров отражения сопровождают также
повреждения, вызванные различными факторами (низко- и высокотемпературный
стресс, высокие интенсивности света, ультрафиолет и пр.). В этих случаях
также наблюдают характерные и направленные изменения спектров отражения
(Merzlyak et al., 1997).
Таким образом, спектр отражения фотосинтезирующей ткани зависит от
содержания в ней различных пигментов и откликается на изменение пигментного
состава ткани. Выяснение зависимостей между пигментным составом ткани и
спектрами отражения позволили выработать ряд методов недеструктивного
анализа пигментного состава растительных тканей, основанных на измерении
коэффициентов отражения при определённых длинах волн. На их основе
рассчитывают индексы, отражающие содержание пигментов в ткани. В таких
индексах используются длины волн, при которых коэффициент отражения
наиболее чувствителен к содержанию того или иного пигмента. Влияние на
отражение других факторов, не связанных с поглощением пигментов, а также
влияние поглощения других пигментов при исследовании какой-то одной их
группы, можно учесть с помощью вычитания или деления на отражение при
других длинах волн, где влияние пигмента на отражение невелико, а влияние
побочного фактора сохраняется. (Merzlyak et al., 1997; Blackburn, 1998;
Gitelson et al., 2001-2003; Merzlyak et al., 2003). Определение содержания
пигментов по полученным таким образом индексам осуществляется по заранее
построенной калибровочной кривой.
Кроме того, в настоящее время на основе коэффициентов отражения
разрабатываются методы оценки физиологического возраста ткани (Merzlyak et
al., 1999; Мерзляк и др., 2003) и работы виолаксантинового цикла (Gamon et.
al., 1992, Penuelas et. al., 1995, Penuelas et. al., 1998, Gamon et. al.,
1999, Nichol et. al., 2006).
В данной работе предлагается использовать следующие индексы:
R800/R700-1 (для определения суммарного содержания хлорофиллов)
R800/R550-1 для определения суммарного содержания хлорофиллов)
R800*(1/R520-1/R550) (для определения содержания каротиноидов)
R800*(1/R520-1/R700) (для определения содержания каротиноидов)

Цели работы:
1. Записать и проанализировать спектры отражения и пропускания для
листьев с различным содержанием пигментов. На основе этих спектров
построить спектр поглощения листа.
2. Построить калибровочную кривую для определения содержания пигментов по
индексам на основе коэффициентов отражения.
3. По построенной калибровочной кривой определить содержание пигментов в
1-2 листьях.
4. Сравнить спектр поглощения целого листа со спектром поглощения
ацетонового экстракта пигментов.

Ход работы.
Для построения калибровочной кривой используют 4-5 листьев любого растения
разного цвета (от зелёного до жёлтого). Из каждого листа делают высечку
диаметром 16 мм и при помощи спектрофотометра Specord 3000 записывают
спектры отражения и пропускания для каждой высечки. По спектрам отражения
рассчитывают индексы по приведённым выше формулам.
Затем из каждой высечки делают экстракт с 80% ацетоном, фильтруют через
стеклянный фильтр при помощи колбы Бунзена и определяют в них содержание
хлорофиллов и каротиноидов. Записывают спектр поглощения каждого экстракта.
По полученным данным строят калибровочную кривую зависимости содержания
пигментов в ткани от индекса, рассчитанного по спектрам отражения.
При помощи полученной кривой определяют содержание пигментов в 1-2 других
листьев того же растения. Проверяют полученный результат, определяя
содержание пигментов в экстракте из исследуемых листьев. Экстракцию
проводят 80% ацетоном.
По полученным спектрам отражения и пропускания рассчитывают и строят спектр
поглощения для каждого использованного листа. Сравнивают их со спектрами
поглощения ацетоновых экстрактов для каждого листа.

Список литературы:
1. Мерзляк М.Н., Гительсон А.А., Чивкунова О.Б., Соловченко А.Е., Погосян
С.И. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших
растений // Физиол. раст. 2003. т. 50 ?5. с. 785-792.
2. Blackburn G.A. Spectral indices for estimating photosynthetic pigment
concentrations: a test using senescent tree leaves // International
Journal of Remote Sensing 1998, V. 19, No. 4, P. 657-675.
3. Gamon J.A., Penuelas J., Field C.B. A narrow-waveband spectral index
that tracks diurnal changes in photosynthetic efficiency // Remote
Sensing of Environment 1992 Vol. 41, no. 1, pp. 35-44.
4. Gamon J.A., Surfus J.S. Assessing leaf pigment content and activity
with a reflectometer // New Phytologist 1999 V. 143 P. 105.
5. Gitelson A.A., Gritz U., Merzlyak M.N. Non destructive chlorophyll
assessment in higher plant leaves: algorithms and accuracy // J. Plant
Physiol. 2003 V. 160, pp. 271-282.
6. Gitelson A.A., Merzlyak M.N., Chivkunova O.B. Optical properties and
nondestructive estimation of anthocyanin content in plant leaves //
Photochem. Photobiol., 2001, V. 74(1), pp. 38-45.
7. Gitelson A.A., Zur Y., Chivkunova O.B., Merzlyak M.N. Assessing
carotenoid content in plant leaves with reflectance spectroscopy //
Photochem. Photobiol. 2002. V. 75(3). P. 272-281.
8. Merzlyak M.N., Gitelson A.A., Pogosyan S.I., Chivkunova O.B., Lehimena
L., Garson M., Buzulukova N.P., Shevyreva V.V., Rumyantseva V.B.
Reflectance spectra of leaves and fruits during their development and
senescence and under stress // Russian Journal of Plant Physiology
1997, V. 44 ?5, pp. 614-622.
9. Merzlyak M.N., Gitelson A.A., Chivkunova O.B., Rakitin V.Y. Non-
destructive optical detection of leaf senescence and fruit ripening //
Physiol. Plant. 1999. V. 106. P. 135-141.
10. Merzlyak M.N., Solovchenko A.E., Gitelson A.A. Reflectance Spectral
Features and Non-Destructive Estimation of Chlorophyll, Carotenoid and
Anthocyanin Content in Apple Fruit // Postharvest Biology and
Technology 2003, V. 27, P. 197-211.
11. Nichol C.J., Rascher U., Matsubara S., Osmond B. Assessing
photosynthetic efficiency in an experimental mangrove canopy using
remote sensing and chlorophyll fluorescence // Trees - Structure and
Function 2006, V. 20, No. 1, P. 9-15.
12. Penuelas J., Filella I., Gamon G.A. Assessment of Photosynthetic
Radiation-Use Efficiency with Spectral Reflectance // New Phytologist
1995, V. 131, No. 3 P. 291-296.
13. Penuelas J., Filella I., Llusia J., Siscart D., Pinol J. Comparative
field study of spring and summer leaf gas exchange and photobiology of
the mediterranean trees Quercus Ilex and Phillyrea latipholia //
Journal of Experimental Botany 1998, V. 49, No. 319, P. 229-238.