Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://chem.msu.ru/rus/vmgu/103/185.pdf Дата изменения: Thu Jan 5 04:48:20 2006 Дата индексирования: Sun Apr 10 10:24:19 2016 Кодировка: Windows-1251

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2010. Т. 51. ? 3

185

УДК 578.74

ПОЛУЧЕНИЕ ГУМАНИЗИРОВАННОГО Fab-ФРАГМЕНТА НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА
П.Г. Свешников , Т.А. Ягудин , Е.В. Морозкина , Е.В.Клячко , С.С. Зацепин , С.В. Беневоленский2, О.Б. Шемчукова3, Л.П. Позднякова3, О.Н. Солопова3 (1кафедра биоинженерии биологического факультета МГУ; 2Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН; 3ОАО 'Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения'; e-mail: petersveshnikov@list.ru)
Получен функциональный гуманизированный Fab-фрагмент нейтрализующего антитела против вируса бешенства - прототип терапевтического средства, способного заменить лошадиный или донорский антирабический иммуноглобулин. Проведено клонирование и секвенирование вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей высокоаффинного нейтрализующего антитела против вируса бешенства. Проведены замена константных мышиных участков на человеческие, наработка гуманизированных Fab-фрагментов в дрожжевой системе экспрессии. Исследованы иммунохимические свойства полученных Fab-фрагментов методами ИФА, электрофореза в ПААГ и вестерн-блота. Получен гуманизированный Fabфрагмент антитела против вируса бешенства, по аффинности превосходящий исходное антитело. Высокая степень гуманизации подтверждена при помощи сывороток, специфичных по отношению к человеческим иммуноглобулинам. Выход гуманизированного Fab-фрагмента составил 21 мг из 1 л культуральной среды, в препарате отсутствуют изолированные легкие и тяжелые цепи гуманизированного Fab-фрагмента.
1 2 2 2 2

Ключевые слова: вирус бешенства, Fab-фрагмент , гуманизация.

Введение По данным Всемирной организации здравоохранения более 55 тыс. человек в мире ежегодно умирают от бешенства, более половины из них - дети до 15 лет [1]. Переносчиками вируса бешенства являются зараженные животные, главным образом собаки. Только в Москве ежегодно фиксируется более 30 тысяч укусов собаками, при этом в большинстве случаев нельзя исключать инфицирование вирусом бешенства, поскольку досимптомной диагностики бешенства не суще ствует. В случае развития симптомов болезнь становится практически неизлечимой и приводит к быстрой смерти [2]. Основным способом борьбы с бешенством на сегодняшний день является иммунизация человека и домашних животных. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует поголовную профилактическую вакцинацию домашних животных (кошек и собак) и антирабическую вакцинацию людей в случае их контакта с животным, у которого подозревается бешенство. После контактов третьей категории, к которым относятся укусы, а также для людей с ослабленной иммунной системой ВОЗ рекомендует пассив21 ВМУ, химия, ? 3

ную иммунизацию, т.е. введение антирабиче ского иммуноглобулина [1]. В качестве такого иммуноглобулина применяют лошадиную сыворотку, содержащую антитела против вируса бешенства. Серьезные побочные эффекты вплоть до анафилактического шока, а также быстрый клиренс заметно ограничивают применение сывороток животного происхождения. Энзиматическое расщепление иммуноглобулинов лошадиной сыворотки до Fab2-фрагментов лишь частично снижает иммунногенность, приводя к существенному удорожанию препарата [3]. Человеческий иммуноглобулин от вакцинированных добровольцев не может удовлетворить всех потребностей в нем. Кроме того, препараты, полученные с использованием человеческого материала, несут в себе опасность ятрогенного инфицирования. Заменой человеческого иммуноглобулина, предохраняющего от заболевания бешенством, могут стать гуманизированные моноклональные антитела, способные нейтрализовать вирус. Ранее в нашей лаборатории была получена панель мышиных моноклональных антител к вакцинному штамму вируса бешенства (ВБ)


186

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2010. Т. 51. ? 3

"Внуково-32" [4]. В результате детального изучения свойств антител [4, 5] было отобрано антитело 1С5, имеющее следующие свойства: 1) взаимодействует с гликопротеидом ВБ; 2) взаимодействует со в с еми исследованными штаммами ВБ (всего было исследовано 33 штамма, среди которых все основные штаммы ВБ, встречающиеся на территории России, а также штаммы из Центральной Европы, Украины, США и Африки); 3) обладает вируснейтрализующей активностью 7 порядка 10 LD50 как по отношению к вакцинному штамму "Внуково-32", так и по отношению к диким штаммам ВБ, тогда как аналогичный показатель для коммерческого лошадиного иммуноглобулина составляет 6,6 102 LD50; 4) обладает 100%-м лечебным действием: мыши, зараженные сверхлетальными дозами ВБ (8 - 10 LD50), выживали без развития симптомов бешенства, если в течение 2-48 ч после заражения им был введен препарат на основе антитела 1С5. Коммерческий лошадиный иммуноглобулин защищал только 16% зараженных животных. Все перечисленные выше свойства антитела 1С5 дают ему явные преимущества по сравнению с лошадиным иммуноглобулином. К этому нужно добавить простоту стандартизации препаратов на основе моноклональных антител по сравнению с поликлональными сыворотками. Однако антитело мышиного происхождения не может считаться идеальным терапевтиче ским средством, по скольку имеет иммунногенные свойства. Для устранения иммунногенности конст антные области мышиного антитела должны быть заменены на человеческие. Материалы и методы Для амплификации плазмид мы использовали штамм E. coli Top10F (Invitrogen), для дрожжевой т ранс форм ации - шт амм Pichia pastoris GS115 (Invitrogen). Вектор pPICZA (Invitrogen) использовали для создания дрожжевых экспрессионных векторов. Для построения пространственной модели Fvфрагмента антитела 1С5 по его аминокислотной последовательности использовали Интернет-программу WAM [6]. ДНК-фрагменты, кодирующие тяжелую и легкую цепи гуманизированного Fab-фрагмента антитела 1С5, были синтезированы из перекрывающихся олигонуклеотидов [7] и клонированы по сайтам XhoI-XbaI в вектора pPICZA и pPICZA-PmeI соответственно. В ре зультате были получены плазмиды pPICZAAR-H и pPICZA-PmeI-AR-L. Плазмида pPICZA-

AR-HL, содержащая обе цепи Fab-фрагмента в составе вектора, была получена путем клонирования BglII-BamHI-фрагмента вектора pPICZA-PmeI-ARL в BglII-сайт вектора pPICZA-AR-H. Плазмида была линеаризована по PmeI и введена в клетки штамма GS115 с помощью электропорации [8]. Трансформанты были отобраны на полной среде с глюкозой (YPD), содержащей ZeocinTM в концентрации 100 мкг/мл. Интеграция линеаризованного вектора в геном рекомбинантных клонов P. pastoris подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров, специфичных к генам антител и геномной ДНК трансформантов в каче стве матрицы [9]. Отобранные трансформанты выращивали аналогично методике, приведенной в [10]. Культура льные жидкости трансформантов проанализированы с помощью непрямого ИФА. Определение констант связывания антител проводили, как описано в методике [11], с модификациями [12]. Специфичность моноклонального антитела определяли методом вестерн-блот [13], используя гликопротеид ВБ. Степень чистоты рекомбинантного человеческого Fab контролировали при помощи электрофореза в 10%-м полиакриламидном геле в присутствии SDS в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях в ступенчатой буферной системе Лэмлли [14]. Результаты Гены, кодирующие мышиное моноклональное антитело (мАт) 1С5, были клонированы из соответствующей гибридомы и секвенированы, как описано в работе [10]. Полученную аминокислотную последовательность вариабельных доменов мАт 1С5 и молекулярное моделирование использовали для конструирования гуманизированного варианта мАт 1С5 аналогично тому, как это было описано для мАт F19 [15]. Сначала были определены границы каркасных областей (Framework), согласно работе [16]. Для каждой каркасной области мы нашли 50 ближайших гомологов в базах данных мышиных и человеческих антительных последовательностей гаметной ДНК. Не сколько систематических различий было найдено при сравнении мышиной и человеческих выборок. Аминокислоты в таких позициях рассматривались в качестве кандидатов на гуманизацию [17]. При анализе последовательностей вариабельных доменов мышиного антитела 1С5 мы идентифицировали возможные ключевые аминокислотные остатки, определяющие связывание с антигеном, а именно определили аминокислотные остатки, которые являются


ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2010. Т. 51. ? 3

187

Рис. 1. Гипотетическая пространственная модель антигенсвязывающего центра мышиного моноклонального антитела 1С5

частью канониче ских структур конформаций CDR, предложенных в работе [18] (эти остатки потенциально участвуют в укладке VL-VH [18]). Были также найдены аминокислоты, редко встречающиеся в последовательностях мышиных антител [19]. При анализе пространственной модели Fv-фрагмента мышиного антитела против вируса бешенства (рис. 1) были определены аминокислотные остатки, которые находятся в радиусе 5 Е от CDR и могут участвовать в связывании с антигеном. Все вышеперечисленные позиции были исключены из числа кандидатов на гуманизацию. В итоге мы получили консенсусную последовательность гуманизированного вариабельного домена антитела 1С5, состоящую из аминокислот, наиболее часто встречающихся в человеческих гомологах мышиного антитела 1С5, а также аминокислот мышиного антитела 1С5, определяющих связывание с антигеном. Из полученных последовательностей были удалены любые потенциальные сайты гликозилирования. Кроме того, были сделаны обратные замены на мышиные аминокислоты из-за опасности нарушить конформацию Fv-фрагмента (3 для тяжелой цепи и 1 для легкой). Таким образом мы получили последовательность гуманизированного вариабельного домена антитела 1С5 (рис. 2). Аминокислотная последовательность цепей гуманизированного Fab-фрагмента была получена путем слияния аминокислотной последовательности гуманизированных VH и VL с аминокислотной последовательно стью челов еч е ских ко нст антных доменов IgG1 CH1 и C-каппа соответственно [20]. Нуклеотидная последовательность цепей гуманизированного Fab-фрагмента была составлена из наиболее часто встречающихся в P. pastoris кодонов.
22 ВМУ, химия, ? 3

Гены легкой и тяжелой цепей Fab-фрагмента гуманизованного антитела 1С5 были синтезированы из набора перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью ПЦР и собраны на экспрессионном векторе pPICZA. В ре зультате мы получили плазмиду pPICZAAR-human-HL, которой т ранс формировали клетки шт амма P. pastoris GS115. Был отобран шт амм GS115/ AR-human, продуцирующий гуманизированные Fab-фрагменты антитела 1С5 с выходом 21 мг/л. Аффинно очищенные из супернатанта Fab-фрагменты сравнивали по связыванию с гликопротеидом ВБ с мышиным Fab-фрагментом и полноразмерным антителом (таблица). Результаты, представленные в таблице, указывают на то, что гуманизированные Fab-фрагменты обладают аффинностью не меньшей, чем у исходного полноразмерного антитела 1С5. Fab-фрагменты при разделении в SDS-ПААГ дают одиночную полосу с мобильностью, соответствующей предполагаемой массе Fab-фрагмента 50 кДа. Электрофорез в восстанавливающих условиях дает полосы, соответствующие предполагаемым значениям массы свободных тяжелых и легких цепей (рис. 3) [21]. Специфичность и степень гуманизации полученных Fab-фрагментов определяли при помощи вестерн-блоЗначения аффинности (Kd) для полноразмерного мышиного антитела 1С5, рекомбинантного мышиного Fab-фрагмента и гуманизированного Fab-фрагмента антитела 1С5

Kd полноразмерное мышиное антитело 1С5 1,9Ч10-9 М рекомбинантный мышиный Fab-фрагмент 2,7Ч10-9 М рекомбинантный гуманизированный Fab-фрагмент 1,2Ч10-9 М


188

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2010. Т. 51. ? 3

а

Mouse RVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKTSGYIFTSFWMHWAKQRPGQGLEWIGQIHPNS DYTNYNEKFRGKATLTVDISSSTVYVDLSGLTSEDSAVYYCAREDYDEGFDNWGQ GTLVTVSA Cons ....V.S...VK.......V.................R.A............... ...........RV.......T.....E....R...T................... ........ Human ....V.S...VV.......V.................R.A............... ...........RA.......T.....E....T...T...................

Mouse

б

DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSRLNWIQQEPDGTIKRLIYATSSLD SGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVGYYCLQYATSPYTFGGGTKLEIKR Cons ..............V.D........................KA............ ................T......QP............................ Human ..............V.D........................GA............ ................T......QP............................
Рис. 2. Сравнение мышиной, консенсусной и гуманизованной аминокислотных по следовательно стей вариабельного домена тяжелой (а) и легкой (б) цепей антитела 1С5

та (рис. 4). Полученный Fab-фрагмент связывает гликопротеид ВБ (данные не приведены). На высокую степень гуманизации указывает тот факт, что моноклональные антитела, специфичные к каппа-цепям иммуноглобулинов человека, узнают гуманизированный Fab-фрагмент, тогда как антитела против каппацепей иммуноглобулинов мыши гуманизированный Fab-фрагмент практически не связывают.

Заключение В результате проведенной работы была определена аминокислотная последовательность вариабельных фрагментов мышиного нейтрализующего антитела против вируса бешенства 1С5. Был получен рекомбинантный Fab-фрагмент этого антитела, не уступающий по аффинности исходному антителу. В результате замены конст антных областей мышиного Fabфрагмента на последовательности, наиболее часто


ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2010. Т. 51. ? 3

189

Рис. 3. Электрофорез в ПААГ гуманизированного Fabфрагмента антитела 1С5: 1 - стандарты, 2 - ЭФ в невосстанавливающих условиях, 3 - ЭФ в восстанавливающих условиях

встречающие ся в человече ских иммуноглобулинах, мы получили гуманизированный Fab-фрагмент. Выход гуманизированного Fab-фрагмента составил 21 мг из 1 л культуральной среды. Примесей изолированных тяжелых и легких цепей, по данным электрофореза и вестерн-блота, обнаружено не было. Специфичность гуманизированного Fab-фрагмента была подтверждена при помощи ИФА и ве стерн-блота, его аффинность не уступает исходному полноразмерному антителу 1С5. Взаимодействие с антителами против каппа-цепей иммуноглобулинов человека при отсутствии заметного связывания с антителами против иммуноглобулинов мыши указывает на высокую степень гу-

Рис. 4. Вестерн-блот гуманизированного Fab-фрагмента в невосстанавливающих (дорожки 1-3) или в восстанавливающих (дорожки 4-6) условиях. Мембраны после переноса инкубировали либо с антителами против каппа-цепей иммуноглобулинов человека (дорожки 1 и 4), либо с антителами против гистидин-6 тага (дорожки 2 и 5), либо с антителами против каппа-цепей иммуноглобулинов мыши (дорожки 3 и 6)

манизации Fab-фрагмента антитела 1С5, что позволяет ожидать снижения иммуногенности последнего при введении в организм человека. Все вышеперечисленное указывает на то, что гуманизированный Fab-фрагмент нейтрализующего антитела 1С5 может быть использован для разработки препарата, способного заменить антирабический лошадиный или донорский иммуноглобулин для профилактики заболевания бешенством.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта АФГИР ? RBO-11041-MO-04 и Госконтракта Роснаука ? 02, 512, 12,2057.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Всемирная организация здравоохранения, информационный бюллетень ? 99. 2008. декабрь. 2. Hildegund C.J. // Negl Trop Dis. 2009. 3. N 9. P. 515. 3. Fernandes A., Kaundinya J.O., Daftary G., Saxena L., Banerjee S. //J. Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed Life Sci. 2008. 876. P. 109. 4. Грибенча С.В., Василенко О.В., Фуралев В.А., Клюшник С.Ю., Кузьмицкая Т.М., Свешников П.Г., Баринский И.Ф. // Вопросы вирусологии. 1991. ? 4 С. 318. 5. Грибенча С.В., Васил енко О.В., Кузьмицкая Т.М., Фурал ев В.А., Свешников П.Г., Татаров А.Г., Колотвина П.В., Баринский И.Ф. // Вопросы вирусологии. 1991. ? 5. С. 399.
23 ВМУ, химия, ? 3

6. Whitelegg N.R.J., Rees A.R. // Prot. Eng. 2000. 13. P. 81. 7. Couto J.R., Blank E.W., Peterson J.A., Ceriani R.L. //Cancer Res. 1995 55. N 8. P. 1717. 8. Gasser B., Maurer M., Gach J., Kunert R., Mattanovich D. // Biotechnol. Bioeng. 2006. 94. N 2. P. 353. 9. Ning Ning D., Junjian X., Xunzhang W., Wenyin C., Qing Z., Kuanyuan S., Guirong R., Xiangrong R., Qingxin L., Zhouyao Y. // J. Biochem. 2003. 134. N 6. P. 813. 10. Ягудин Т.А., Морозкина Е.В., Клячко Е.В., Зац епин С.С., Беневоленский С.В., Солопова О.Н., Шемчукова О.Б. , Городецкая С.Б., Борзилов А.И., Баранова Е.В., Бикетов С.Ф., Вейко В.П., Свешников П.Г. // Молекулярная медицина (в печати).


190 11. Klotz I.M. The Proteins. N.Y., 1953. 12. Friguet B., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M. E. //Journal of Immunological Methods. 1985. 77. P. 305. 13. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. 76. N 9. P. 4350. 14. Laemmli U.K. // Nature. 1970. 227. P. 680. 15. Ягудин Т.А., Марченко А.Н., Морозкина Е.В., Клячко Е.В., Зацепин С.С., Беневоленский С.В., Солопова О.Н., Шемчукова О.Б. , Городецкая С.Б., Борзилов А.И., Баранова Е.В., Бикетов С.Ф., Свешников П.Г. // Молекулярная медицина (в печати). 16. Kabat E.A., Wu T.T., Reid-Miller M., Perry H.M., Gottesman K. S. // U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD. 1987.

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2010. Т. 51. ? 3 17. Staelens S., Desmet J., Ngo T.H., Vauterin S., Pareyn I., Barbeaux P., Van Rompaey I., Stassen J.M., Deckmyn H., Vanhoorelbeke K. //Mol. Immunol. 2006. 43. N 8. P. 1243. 18. Chothia C., Lesk A. M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E. A., Davies D., Tulip W. R., Colman P. M., Spinelli S., Alzari P.M., Poljak R. J. // Nature. 1989. 342. P. 877. 19. Kolbinger F., Saldanha J., Hardman N., Bendig M. // Prot. Eng. 1993. 6. P. 971. 20. Tan P., Mitchell D.A., Buss T.N., Holmes M.A., Anasetti C., Foote J. //J. Immunol. 2002. 15. 169(2). P. 1119. 21. Carter P., Presta L., Gorman C.M., Ridgway J.B.B., Henner D., Wong W.L.T., Rowland A.M., Kotts C., Carver M.E., Shepard H.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89. P. 4285.
Поступила в редакцию 20.01.10

PRODUCTION OF THE HUMANIZED Fab FRAGMENT OF THE NEUTRALIZING ANTIBODY AGAINST RABIES VIRUS
P.G. Sveshnikov, T.A. Yagudin, E.V. Morozkina, E.V. Klyachko, S.S. Zatsepin, S.V. Benevolensky, O.B. Shemchukova, L.P. Pozdnyakova, O.N. Solopova (Chair of bioengineering, Department of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University)
The aim of the investigation is to produce functional humanized Fab fragment of the neutralizing antibody against rabies virus - a prototype of a therapeutic drug, capable of substituting the horse and the donor anti-rabies immunoglobulin. There was performed cloning and sequencing of variable light and heavy chains fragments of a high affinity neutralizing antibody against rabies virus. There was made a substitution of constant mouse fragments for human ones and a production of humanized Fab fragments in the yeast expression system. There were also investigated the immunochemical properties of the obtained Fab fragments by EIA, electrophoresis in PAAG and Western blotting. The humanized Fab fragment of the antibody against rabies virus, which exceeded the initial antibody in terms of affinity, was produced. The high humanization degree was proved with the used of the sera, specific towards human immunoglobulins. The yield of the humanized Fab fragment made up 21 mg per 1 L of the culture medium, the absence of isolated light and heavy chains of the humanized Fab fragment was testified.

Key words: rabies virus, Fab fragment, humanization.
С в е дения об ав т орах: Свешников Петр Ге оргиевич - профе ссор к а ф е дры биоинж енерии био логиче с ког о факультет а МГУ, докт. биол. наук (petersveshnikov@list.ru); Ягудин Тимур Анверович - мл. науч. сотр. лаборатории оптимизации экспре ссии генов Институт а биохимии им. А.Н. Баха РАН (mitok@mail333.com); Морозкина Ел ена Вл адимировна - науч. сот р. лаборатории оптимизации экспре ссии генов Институт а биохимии им. А.Н. Баха РАН, канд. био л. наук (morozkina@inbi.ras.ru); Клячко Ел ена Вит альевна - ст. науч. сот р. лаборатории оптимизации эк спре ссии генов Инстит ут а био химии им. А.Н. Бах а РАН, к анд. био л. нау к (eklyachko@yandex.ru); Зац епин С ергей Сергеевич - ст. науч. сот р. лаборатории оптимизации экспре ссии генов Институт а биохимии им. А.Н. Баха РАН, канд. биол. наук (zatsepin@inbi.ras.ru); Беневол енский С ергей Вл адимирович - ве д. науч. со т р . лаборатории оптимизации экспре ссии г енов Инстит у т а биохимии им. А.Н. Бах а РАН, канд. биол. наук (benevol@inbi.ras.ru); Шемчукова Ольга Борисовна - ст. науч. сотр. отдела биотехнологии ОАО 'Вс еро ссийский научный Цент р мо лекулярной диагно стики и ле чения', к анд. биол. нау к (itreata@yandex.ru); Позднякова Любовь Петровна - науч. сот р. отдела биотехнологии ОАО 'Вс еро ссийский научный Цент р молекулярной диагно стики и лечения' (e-mail: plp1810@inbox.ru); Сол опова Ольга Никол аевна - вед. науч. сот р. отдела биотехнологии ОАО 'Вс еро ссийский научный Цент р молекулярной диагно стики и лечения', канд. биол. наук (solopova@msn.com).