Курсовая работа студентки 4-го курса кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ. Москва, 2001.
Авторские права сохранены. Любое копирование данного текста и/или его фрагментов без разрешения автора запрещено и преследуется в соответствии с действующим законодательством РФ.

Содержание    В начало...
 
 

4.2. Семейство Closteroviridae

Представители данного семейства - переносимые насекомыми вирусы растений, характеризующиеся целым рядом отличительных особенностей.

- Клостеровирусы имеют очень длинные и гибкие нитевидные частицы (до 1400-2000 нм в длину), построенные из двух родственных капсидных белков, один из которых формирует короткий "хвост" на конце частицы;

- Клостеровирусы имеют РНК-геномы очень большого размера (от 15,5 до 19,3 kb), несущие 9-11 генов;

- Кроме доменов метилтрансферазы (МТ), хеликазы (ХЕЛ) и РНК-полимеразы (ПОЛ), характерных для всех Синдбис-подобных вирусов, геномы клостеровирусов кодируют некоторые домены, характерные для отдельных представителей разных вирусных суперсемейств (домен П-Про), а также несут гены, консервативные внутри данного семейства (белка, гомологичного клеточным шаперонам HSP70; маленького гидрофобного белка; белка с мол.весом около 60 кDа; мажорного и минорного структурных белков) или уникальные гены (Agranovsky, 1996).

Схемы строения геномов представителей двух родов семейства Сlosteroviridae (Closterovirus и Criniviris) представлены на Рис. 3.

Рис. 3. Строение геномов ВЖС и ВИЖЛ. Изогнутой стрелкой обозначен предполагаемый участок рибосомального сдвига рамки считывания.

Род Closterovirus включает в себя переносимые тлями вирусы с однокомпонентным геномом - вирус тристецы цитрусовых (ВТЦ), вирус желтой карликовости свеклы (ВЖКС) и некоторые другие. Типичным представителем рода является вирус желтухи свеклы (ВЖС).

Однокомпонентный геном ВЖС представлен молекулой РНК размером 15480 нт, содержащей кеп-структуру на 5'-конце. На 3'-конце предполагается наличие двух относительно стабильных шпилек, которые, возможно, служат сигналами репликации. Геномная РНК ВЖС содержит 9 ОРС (Рис 3). Протяженная ОРС 1а кодирует полипротеин с молекулярной массой 295 kDa, содержащий домены П-Про, МТ и ХЕЛ. ОРС 1b кодирует полимеразу, которая синтезируется, вероятно, в составе 348 kDa слитного продукта образуемого в результате +1 рибосомального сдвига рамки считывания. ОРС 2-4 кодируют, соответственно, 6 kDa гидрофобный белок, 65 kDa белок, близкородственный клеточным шаперонам семейства HSP70, и 64 kDa белок. ОРС 5 и 6 кодируют минорный и мажорный компоненты капсида. На 3'-конце расположены ОРС 7, кодирующая 20 kDa белок с неизвестной функцией, и ОРС 8, продукт которой, 21 kDa белок, является активатором амплификации генома (Peremyslov et al., 1998). ОРС 3-8 экспрессируются с помощью сгРНК (Agranovsky et al., 1994; Agranovsky, 1995). У ВТЦ ОРС 1а более протяженная, чем у других клостеровирусов, из-за дупликации цистрона П-Про (Karasev et al., 1995).

В результате компьютерного анализа последовательности продукта ОРС 1а в его N-концевой части был идентифицирован домен П-Про, причем компьютерные сравнения показали его наибольшую близость к П-Про потивирусов (Agranovsky et al., 1994). С помощью клонирования кДНК данного участка генома ВЖС в бактериальный вектор и последующих экспериментов по транскрипции и трансляции in vitro была подтверждена протеиназная активность гипотетического домена П-Про. В экспериментах точечному мутагенезу были выявлены каталитические остатки Cys509 и His569 и сайт разрезания между остатками Gly в позициях 588-589. У ВТЦ участки разрезания обеих протеиназ были выявлены при компьютерном анализе белковых последовательностей и соответствуют остаткам Gly484 / Gly 485 и Gly976 / Gly977 (Agranovsky et al., 1994; Karasev, 1995).

Анализ репликативных белков ВЖС, синтезируемых в зараженной клетке, с помощью Вестерн-блотов и моноклональных антител к доменам МТ и ХЕЛ показал, что МТ и ХЕЛ присутствуют in vivo в составе 63К и 100К белков, соответственно, что указывает на сложный процессинг 1а белка: помимо предполагавшегося ранее автокаталитического выщепления 66К лидерной протеиназы, происходит дальнейшее разрезание 1а полипротеина по крайней мере еще на три фрагмента (Erokhina et al., 2000). Активность, осуществляющая дополнительные акты протеолиза, пока не была идентифицирована. Возможно, они осуществляются П-Про in trans или же клеточными протеиназами (Erokhina et al., 2000).

Интересно, что N-концевая лидерная протеиназа ВЖС бифункциональна. Ее С-концевой домен обладает автопротеолитической активностью, а N-концевой домен важен для накопления вирус-специфических РНК в клетке, а также влияет на жизнеспособность вируса в инфицированном растении (Peremyslov et al., 1998). При заражении растений мутантами с рамочной делецией первых 54 триплетов гена 1а наблюдался лишь базальный уровень синтеза геномных вирусных РНК. На основе анализа различных мутантов по 5'-концу гена протеиназы возникло предположение, что данный участок может действовать на двух уровнях. На уровне РНК он, возможно, является необходимым для репликации, влияя на образование вторичной структуры геномной РНК, либо выступая как цис-сигнал репликации. На уровне белка он, скорее всего, действует как транс-активатор репликации вирусной РНК в клетке (Peng and Dolja, 2000).

При компьютерном анализе генома ВЖС между предполагаемыми доменами МТ и ХЕЛ был обнаружен участок (примерно в 100 остатков), по аминокислотной последовательности напоминающий аспартиловую протеиназу ВИЧ и других лентивирусов. В связи с этим возникло предположение о том, что за счет дополнительного протеиназного домена происходит еще одно разрезание полипротеина (Agranovsky et al., 1994). Однако, сходство этого домена в белке ВЖС и кислых протеиназ очень незначительно, и эта гипотеза до сих пор не получила экспериментального подтверждения.

Отмечалось, что с точки зрения стратегии экспрессии генома, включающей протеолитический процессинг лидерной П-Про (вплоть до таких деталей, как наличие одиночного или сдвоенного доменами лидерной П-Про у разных представителей внутри одной группы), рибосомальный фреймшифтинг и образование набора сгРНК, клостеровирусы больше напоминает корона-подобные вирусы, чем родственных представителей супергруппы Синдбис-подобных вирусов. Высказывалось предположение, что сходные механизмы экспрессии корона-подобных вирусов и клостеровирусов, которые эволюционно удалены, возникли конвергентно в результате эволюции больших РНК геномов (Agranovsky et al., 1994; Agranovsky, 1995). Вместе с тем, нельзя не отметить, что процессинг 1а полипротеина ВЖС, приводящий к появлению зрелых белков с доменами МТ и ХЕЛ, напоминает процессинг предшественника неструктурных белков nsP1-4 у альфавирусов.

4.2.2. Род Crinivirus

Представители данного рода - вирус инфекционной желтухи салата-латука (ВИЖЛ) и вирус увядания жилок батата, переносимые белокрылками, в настоящее время относят к отдельному роду Crinivirus (Duffus et al., 1986; Klaassen et al., 1994). Геномы кринивирусов разделены между двумя компонентами, РНК-1 и РНК-2 (7,2 и 8,1 kb для ВИЖЛ). РНК-1 кринивирусов содержит три ОРС. ОРС 1а и 1b гомологичны таковым у клостеровирусов. ОРС 1а кодирует полипротеин, содержащий домены П-Про, МТ и ХЕЛ, а ОРС 1b - РНК-полимеразу. ОРС 2 кодирует уникальный 31 kDa белок, который экспрессируется с помощью сгРНК. РНК-2 содержит гены маленького гидрофобного белка, гомолога HSP70, 59К, родственного 64К ВЖС и 61К ВТЦ, уникальный 9К белок, 28К мажорный СБ, 52К минорный СБ и уникальный 26К белок.

Сравнение протеиназных доменов ВИЖЛ и ВЖС показало, что в П-Про кринивирусов каталитическими остатками также могут быть Cys и His, а разрезание, приводящее к выщеплению гипотетического 45 кDa лидера, может происходить между остатками глицина и аланина, а не по глицин-глициновому дипептиду, как в случае ВЖС и ВТЦ (Klaassen et al., 1994).

4.3. Род Tymovirus

Род Tymovirus объединяет вирусы растений со сферическими частицами, содержащие неразделенный РНК геном длиной 6,3 kb. Типичным представителем этого рода является вирус желтой мозаики турнепса (ВЖМТ).

Геномная РНК содержит кеп на 5'-конце и тРНК-подобную структуру на 3'-конце. Геном содержит три гена. На 5'-конце расположен ген транспортного белка с мол.весом 69 кДа, который почти полностью перекрывается с геном репликазы (206 кDa), кодирующей домены МТ, ХЕЛ, П-Про и ПОЛ (Morch et al., 1988). За счет проскока терминирующего кодона на конце репликазного гена, продукт трансляции последнего может удлиняться до 221 kDa. П-Про расщепляет репликативный полипротеин на N-концевой (141 kDa) и С-концевой (66 kDa) продукты (Bransom et al., 1991), причем процессинг необходим для репликации РНК в клетке (Bransom and Dreher, 1994). 3'-концевая ОРС, частично перекрывающаяся с ОРС репликазы, кодирует СБ, который синтезируется с сгРНК. Схема строения генома ВЖМТ представлена на Рис.4.

Рис. 4. Строение генома ВЖМТ.

Папаин-подобная протеиназа у тимовирусов была предсказана на основании компьютерного анализа. Тот факт, что консервативные Cys и His (кандидаты на каталитическую пару) сопровождаются гидрофобными аминокислотными остатками, дал основания предполагать, что протеиназа тимовирусов является папаин-подобной (Gorbalenya et al., 1991; Rozanov et al., 1995). Принадлежность фермента к тиоловым протеиназам была подтверждена экспериментами с ингибиторами. Так, ZnCl2 подавлял автопротеолиз даже в низких концентрациях (Morch et al., 1989). На основании сравнения последовательностей протеиназных доменов у нескольких тимовирусов была предсказана каталитическая пара - Cys783 и His869, а также важный для автопротеолиза, консервативный у всех представителей рода остаток Asp739, что впоследствии было подтверждено экспериментами с сайт-специфическим мутагенезом: замена любого из них приводила к подавлению процессинга полипротеина in vitro. Тем не менее, в экспериментах in vivo замена Asp739 не подавляет репликации вируса, хотя и снижает ее уровень в 50-100 раз. (Bransom et al., 1994; Rozanov et al., 1995). Протеиназный домен был приблизительно локализован путем введения делеций и вставок в ген репликазы, а эффект этих мутаций оценивался либо по результатам трансляции in vitro, либо по способности мутанта к репликации в протопластах. Предполагается, что домен протеиназы у ВЖМТ ограничивается остатком 731 с N-конца и остатком 885 с С-конца (Bransom et al., 1994).

Сайт разрезания тимовирусной протеиназы находится между доменами ХЕЛ и ПОЛ (Bransom et al., 1991). У ВЖМТ разрезание происходит между двумя Ala1259 и Thr1260. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов с сайт-специфическим мутагенензом. Последовательность, окружающая участок разрезания была установлена путем секвенирования продуктов процессинга ВЖМТ:

Наиболее важны для узнавания остатки, находящиеся в позициях Р4-Р2. При замене Leu-Asn-Gly на Ala-Ala-Ala автопротеолиз репликазы полностью подавляется. Замена в позициях P1-P2' на Gly-Ala-Ala приводит к уменьшению интенсивности разрезания (Bransom et al., 1991; Kadare et al., 1995; Bransom et al., 1996).

По-видимому, протеиназа тимовирусов не способна работать in trans (как и большинство других папаин-подобных протеиназ, за исключением nsP2 альфавирусов). При совместной трансляции двух мутантов, один из которых был дефектен по протеиназе (источник субстрата), а другой - по сайту разрезания (источник протеиназы), процессинга полипротеина не наблюдалось (Вransom et al., 1994; Rozanov et al., 1995). Тем не менее, результаты данного эксперимента не могут служить безоговорочным доказательством отсутствия разрезания in trans у тимовирусов. Данные эксперимента по совместной трансляции мутанта с дефектной протеиназой и мРНК тимовирусного фермента, цистрон которого был бы заклонирован отдельно, были бы более убедительными.

На основании компьютерного анализа и сравнения последовательностей репликаз пяти представителей тимовирусов, а также капилловирусов, карлавирусов, ВРСЯ, ВХПЯ и ВНПЖС, предполагаемые протеиназы этих вирусов были выделены в отдельную подгруппу "тимо-подобных" протеиназ (Rozanov et al., 1995). Сходство последовательностей тимо-подобных и других вирусных папаин-подобных протеиназ весьма мало (за исключением аминокислот, окружающих каталитические Cys и His). Тем не менее, каталитический остаток цистеина у тимо-подобных протеиназ сопровождается лейцином, метионином или валином, тогда как у остальных вирусных папаин-подобных протеиназ в этой позиции находится, как правило, остаток ароматической аминокислоты. Отличительным признаком данной группы протеиназ служит также консервативность остатка глицина наряду с каталитическими Cys и His (у ВЖМТ - Gly821). У протеиназы ВНПЖС этот консервативный остаток отсутствует, хотя этот домен в целом имеет статистически значимое сходство с тимо-подобными протеиназами (Rozanov et al., 1995).

Далее...