Занятие 10 (зачетное)

1. Определение инструментов для решения поставленной задачи.

   Полный протеом E. coli был получен из Swiss-Prot командой seqret sw:*_ecoli, которая записала в файл ecoli.fasta последовательности всех белков банка SwissProt, ID которых оканчивается на "ecoli".
   
   Индексные файлы этого протеома для поиска программами пакета BLAST были созданы командой
   formatdb -i ecoli.fasta -p T -n ecoli
   

2. Получение трансляций всех открытых рамок считывания

   Из данного фрагмента трансляции были извлечены все открытые рамки считывания длиной не менее 240 нуклеотидов. Это было сделано программой getorf с соответствующими параметрами:
   getorf -table 11 -minsize 240 -find 1 -sequence frag1.fasta
   При этом был использован стандартный для бактерий генетический код, а открытой рамкой считалась последовательность, начинающаяся со старт-кодона и заканчивающаяся стоп-кодоном.
   
   В результате было получено 15 открытых рамок, которые записаны в файле frag1.orf.

3. Поиск сходных последовательностей у E.coli

   Для поиска последовательностей из протеома E.coli, сходных с найденными рамками считывания, была использована программа blastp (именно она ищет гомологи белковой последовательности по банку другой белковой последовательности). Нам были необходимы находки с E-value < 0,001, поэтому команда выглядела так:
   blastall -p blastp -d ecoli -i frag1.orf -o found.txt -e 0.001 -m 8
   
   В каждой строчке полученного файле в первом столбце находится название одной из рамок считывания, а в остальных - характеристики найденной гомологичной ей последовательности из белков E.coli. Чтобы понять, сколько гомологов найдено для каждой рамки, был написан специальный скрипт, результаты работы которого лежат в файле res.txt, где цифры показывают количество находок для каждой из 15 рамок считывания.
   
   в результате был составлен документ credit.xls (лист "results"), содержащий информацию обо всех открытых рамках считывания в данном мне фрагменте генома. Для каждой рамки указано: начало во фрагменте, конец во фрагменте, направление (прямое или обратное), число сходных последовательностей, найденных у E. coli при условии E-value<0,001.
   
   На том же листе также приведена таблица, содержащая эту информацию только для тех открытых рамок, для которых нашлась хотя бы одна сходная последовательность. В этой таблице присутствуют два дополнительных столбца, в которых приведены идентификатор самого близкого из найденных белков E. coli и E-value находки.

4. Гипотетические гены во фрагменте 98001-105000 записи AALD01000001

   Ниже изображено схематическое положение на фрагменте тех открытых рамок, для которых нашлись сходные последовательности в E. coli. Одна рамка обозначается одной записью в квадратных скобках.

   
   5'---[=>efeu, 6-743]------[=>macb, 2891-4186]-3'
   				     5'-[=>lole, 4113-5333]--[=>ybba, 5340-6050]-3'
   						        		5'-[=>dsbe, 5980-6540]-----3'
   
   

   Здесь для каждой рамки значок => обозначают прямую цепь ДНК, "xxxx" - название самого сходного гена у E. coli, а цифры - это координаты границ открытой рамки во фрагменте. Хорошо видно, что в двух случаях имеет место перекрывание генов.

5. Взаимное расположение предполагаемых генов данного фрагмента и гомологичных им генов в геноме кишечной палочки

   Ниже изображено схематическое положение пяти генов E. coli, самых близких к нашим пяти рамкам. Каждый ген обозначается одной записью в квадратных скобках. Обозначания те же, что и на предыдущей схеме, значок <= обозначают комплементарную цепь ДНК.

   
   5'--[=>ybba, 518'957-519'643]--[=>macb, 919'570-921'516]--[=>efeu, 1'080'579-1'081'408]--3'
   5'-[=>lole, 1'176'543-1'177'787]---------------------------------------------------------3'
   			        		
   3'--------------------------------------------------[<=dsbe, 2'290'429-2'290'986]--------5'
   

   Как видно из схемы, гены кишечной палочки расположены достаточно далеко друг от друга. В относительной близости лежат только два гена, кодирующие белки macb_ecoli и efeu_ecoli. Однако взаимное расположение этой пары неконсервативно: хотя в обеих бактериях эти гены лежат на прямой цепи, у Y. mollaretii рамка, соответствующая гену macb, идет после рамки, соответствующей гену efeu, а у E. coli ген macb идет до гена efeu.