Построение парного выравнивания исследуемого белка и заданного прототипа.
Последовательности и нумерация остатков в БД PDB и БД UniProt могут различаться. Поэтому получаю и сравниваю обе последовательности белка-прототипа (это нужно для проверки предсказаний трансмембранных участков исследуемого белка):- P47863 - поиск велся в SRS по БД UniProt; запрос выглядит так: [uniprot-AccNumber:P47863]. Полученная последовательность сохранена в формате ".fasta".
- 2D57 - это PDB ID белка-прототипа. Поиск велся в RCSB Protein Data Bank (PDB-код вводится в окно поиска; по окончанию поиска выбирается раздел "FASTA Sequence" и соответствующая
последовательность сохраняется.
Нумерация в PDB начинается с 23-го нуклеотида.
Белок-прототип - аквапорин-4 (AQP-4, WCH4, Mercurial-insensitive water channel) из организма Rattus norvegicus (крыса) - мембранный белок, формирующий водный канал; осморецептор, регулирующий водный баланс.
Полученные последовательности необходимо сравнить. Для этого создается выравнивание; вид команды:
needle P47863.fasta 2D57.fasta -gapopen 10 -gapextend 0.5 stdout >> prototip.msfВот полученное выравнивание:
########################################
# Program: needle
# Rundate: Wed Apr 04 2007 10:26:35
# Commandline: needle
# [-asequence] 2D57.fasta
# [-bsequence] P47863.fasta
# -outfile prototip.msf
# Align_format: srspair
# Report_file: prototip.msf
########################################
#=======================================
#
# Aligned_sequences: 2
# 1: 2D57-SEQ
# 2: AQP4_RAT
# Matrix: EBLOSUM62
# Gap_penalty: 10.0
# Extend_penalty: 0.5
#
# Length: 323
# Identity: 301/323 (93.2%)
# Similarity: 301/323 (93.2%)
# Gaps: 22/323 ( 6.8%)
# Score: 1551.0
#
#
#=======================================
2D57-SEQ 1 ----------------------MVAFKGVWTQAFWKAVTAEFLAMLIFVL 28
||||||||||||||||||||||||||||
AQP4_RAT 1 MSDGAAARRWGKCGPPCSRESIMVAFKGVWTQAFWKAVTAEFLAMLIFVL 50
2D57-SEQ 29 LSVGSTINWGGSENPLPVDMVLISLCFGLSIATMVQCFGHISGGHINPAV 78
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AQP4_RAT 51 LSVGSTINWGGSENPLPVDMVLISLCFGLSIATMVQCFGHISGGHINPAV 100
2D57-SEQ 79 TVAMVCTRKISIAKSVFYITAQCLGAIIGAGILYLVTPPSVVGGLGVTTV 128
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AQP4_RAT 101 TVAMVCTRKISIAKSVFYITAQCLGAIIGAGILYLVTPPSVVGGLGVTTV 150
2D57-SEQ 129 HGNLTAGHGLLVELIITFQLVFTIFASCDSKRTDVTGSVALAIGFSVAIG 178
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AQP4_RAT 151 HGNLTAGHGLLVELIITFQLVFTIFASCDSKRTDVTGSVALAIGFSVAIG 200
2D57-SEQ 179 HLFAINYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHWIYWVGPIIGAVLAGALYEY 228
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AQP4_RAT 201 HLFAINYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHWIYWVGPIIGAVLAGALYEY 250
2D57-SEQ 229 VFCPDVELKRRLKEAFSKAAQQTKGSYMEVEDNRSQVETEDLILKPGVVH 278
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AQP4_RAT 251 VFCPDVELKRRLKEAFSKAAQQTKGSYMEVEDNRSQVETEDLILKPGVVH 300
2D57-SEQ 279 VIDIDRGDEKKGKDSSGEVLSSV 301
|||||||||||||||||||||||
AQP4_RAT 301 VIDIDRGDEKKGKDSSGEVLSSV 323
|
Одно из возможных объяснений (? - разумное ли, но все же...): похоже, что в моем случае, отсутствующий в PDB участок представляет собой так называемую "сигнальную последовательность", богатую гидрофобными аминокислотными остатками. Она синтезируется первой и необходима для верного "заякоривания" рибосом на мембране ЭПР и начала встраивания белка в мембрану, после чего "сигнальная последовательность" ферментативно удаляется в полости ЭПР. Вот почему при выделении белка (уже "зрелого") из мембраны, сигнальная последовательность отсутствует - нет ее и в PDB.
Последовательность белка для исследования - Q8UVB8 ищется по идентификатору UniProt в SRS; запрос [uniprot-AccNumber:Q8UVB8] . Это аквапорин из организма Coturnix coturnix (перепел обыкновенный).
Далее строится парное выравнивание этой последовательности и последовательности белка-прототипа из PDB (идентификатор 2D57) c помощью программы ClustalW [предварительно создается файл, содержащий обе последовательности]; вид команды:
emma vmeste.fasta
Полученное выравнивание экспортировано в GeneDoc:
Характеристики выравнивания:
- процент идентичности - 79%;
- процент сходства - 85%;
- число гэпов (гэпы только концевые) - 10%.
Итак, судя по выравниванию, сходство последовательностей высокое; функции рассматриваемые белки выполняют одинаковые. А это значит, что рассматриваемые белки - ортологи.
Выравнивание, экспортированное в GeneDoc, сохранено в файле под названием marking.msf (внимание!: здесь и далее ссылка приводится на файл в формате HTML, это обеспечивает "сохранность" раскраски и удобство просмотра результатов).
Разметка мембранных сегментов на выравнивании.
По идентификатору PDB 2D57 белка-прототипа найдено описание ориентации белка в мембране в БД OPM (Orientations of Proteins in Membranes database). Оказалось, что исследуемый белок - тетрамер. В каждой из субъединиц содержится 8 альфа-спиральных трансмембранных участков (ВАЖНО: в PDB нумерация начинается с 23 а.о.):- 34-56, длина 23;
- 70-88, длина 19;
- 98-107, длина 10;
- 112-136, длина 25;
- 156-178, длина 23;
- 189-203, длина 15;
- 214-223, длина 10;
- 231-252, длина 22;
- N-конец - цитоплазматический.
Учитывая, что мембрана имеет конечную толщину (в среднем около 30 Å ), трансмембранной спирали соответствует примерно 20 остатков. Из полученных 8ми, 4 спирали имеют длину приблизительно равную 20; одна спираль имеет длину в 25 а.о.; остальные 3 - "короткие" (10, 10 и 15 а.о.).
В выдаче ОРМ есть визуализация белка: похоже, что "короткие" спирали пронизывают только по одному из липидных слоев мембраны.
В полученном ранее файле marking.msf ниже последовательности прототипа добавлена последовательность с названием "OPM" и разметкой ТМ сегментов (как это делалось - см. подсказки: в соответствующих последовательностях отмечаются позиции мембранных сегментов буквой "Н", позиции цитоплазматических петель знаком "+", остальные - знаком "-" (серым выделены остатки, отсутствующие в Q8UVB8)).
Предсказание топологии заданного белка с помощью наиболее популярной программы (TMHMM).
Топология заданного белка - белка Q8UVB8 - предсказывается с помощью сервера TMHMM - предсказание трансмембранных спиралей белка (на вход программе подается fasta-последовательность исследуемого белка (либо файл, содержащий такую последовательность)); опции выбраны по умолчанию; особенно "Output format: Extensive, with graphics" - графическое представление).Число предсказанных трансмембранных спиралей (ТМС) составляет 6. Указаны границы ТМС, внешних и внутренних (по отношению к мембране) участков белка; кроме того, приводится диаграмма, отражающая апостериорную вероятность "встречаемости" указанных элементов.
Страничка с результатом предсказания прикреплена к протоколу.
К последовательностям в файле marking.msf добавлена еще одна искусственную последовательность с разметкой ТМ сегментов, отражающая результаты данного предсказания - последовательность "TMHMM" (опять же, отмечаются позиции мембранных сегментов буквой "Н", позиции цитоплазматических петель знаком "+", остальные - знаком "-").
Оценка качества предсказания.
Полученное предсказание TMHMM сравнивается с данными ОРМ. Для этого рассматривается выравнивание, результаты сравнения заносятся в таблицу - см. ниже. Для оценки качества предсказания (подсчета ТР и пр.) написан программный код на языке JAVA (см. этот текстовый файл - реализация в JBuilder).
| Число а.к. остатков | |
| Всего а.к. остатков | 335 |
| Остатки, предсказанные как локализованные в мембране (всего) | 138 |
| Правильно предсказали (true positives, TP) | 119 |
| Предсказали не то, что нужно (а.о. предсказаны как мембранные, а по данным ОРМ таковыми не являются, false positives, FP) | 19 |
| Правильно не предсказали ( не предсказаны, и по данным ОРМ не находятся в мембране, true negatives, TN) | 170 |
| Не предсказали то, что нужно (остатки по данным ОРМ находятся в мембране, false negatives, FN) | 27 |
| Доля | |
| Чувствительность (sensitivity) = TP / (TP+FN) | 0.8150 |
| Специфичность (specificity) = TN / (TN+FP) | 0.8995 |
| Точность (precision) = TP / (TP+FP) | 0.8623 |
| Сверхпредсказание = FP/ (FP+TP) | 0.1377 |
| Недопредсказание = FN / (TN+FN) | 0.1371 |
Что получается: после просмотра выравнивания оказалось, что предсказания TMHMM достаточно точные: предсказаны 6 трансмембранных спиралей, пронизывающих билипидный слой мембраны. Непредсказанными оказались только 2 "коротких" спирали (по 10 а.о. каждая) - тут очевидна связь с особенностями алгоритма ТМНММ (с тем, что скрытые марковские модели используются для предсказания; и "стандартной" трансмембранной спиралью считается спираль длиной около 20 а.о.). Правильно предсказано и положение цитоплазматических петель / ориентация в цитоплазматической мембране (за исключением петель между 3 и 5 предсказанными спиралями - сказалась непредсказанность коротких альфа-спиралей ).
Как оказалось, у TMHMM весьма высокие специфичность, чувствительность и точность ( >0.80 или >80% ). В то же время ,низка доля ( <0.15 ) сверх- и недопредсказаний. Все это делает программу TMHMM подходящей для достаточно разумного предсказания топологии мембранных белков (во всяком случае, для предсказания белков с топологией "петля - трансмембранная спираль - петля").
Напоследок привожу файл marking в различных форматах:
- marking.msf - действительно в формате msf;
- marking.html;
- marking.aln - в виде текстового файла формата Clustal.
