Программы пакета BLAST для работы с нуклеотидными последовательностями

Поиск в геноме участков, кодирующих белки, похожие на заданный

• xc_genome.fasta - полный геном возбудителя черной гнили капусты Xanthomonas campestris;
Я знаю аминокислотную последовательность моего белка IHFB_ECOLI p0a6y1.fasta. Нужно определить, закодированы ли похожие белки в геноме другого организма (Xanthomonas campestris), не пользуясь аннотацией генома. Я создал в своей рабочей директории индексные файлы пакета BLAST для поиска по заданному геному. Для поиска гомологов моего белка выбрал программу tblastn пакета BLAST.

Запущены следующие команды:

     formatdb -i xc_genome.fasta -n xc -p F
     blastall -p tblastn -d xc -i p0a6y1.fasta -e 0.001 > p0a6y1.out

Выходной файл: p0a6y1.out

Поиск гомологов белка RBSB_ECOLI в геноме Xanthomonas campestris

Число находок с Е-value<0,001		3
Характеристика лучшей находки:
	E-value находки	9e-32
	Название геномной последовательности	>AE012326 AE008922 Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913, section 234 of 460 of the complete genome.
	Координаты выравнивания(-ий) в найденной последовательности	7801-7529

Нахождение записи EMBL по последовательности с помощью программы BLASTN

Последовательность из первого задания была вырезана в файл ae012537.fasta
Выполненные команды:

seqret -sask
     Reads and writes (returns) sequences
     Input (gapped) sequence(s): xc_genome.fasta:AE012326
         Begin at position [start]: 7529
           End at position [end]: 7801
            Reverse strand [N]: Y
     output sequence(s) [ae012537.fasta]:

Выходной файл: ae012326.fasta

На сайте EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/) запустим поиск этой последовательности в банке "EMBL standard prokaryote".

Необходимо: На страничке "Bioinformatic tools" пойдите по гиперссылке "BLAST" и выберите "NCBI-BLAST2 Nucleotide". Нужные параметры стоят на странице сервиса по умолчанию. Выберите нужный банк в меню "Database". Последовательность можно скопировать из файла в окошко, но можно и не делать этого, а взамен воспользоваться функцией "Upload a file". На странице с результатом поставьте галочку в checkbox против первой находки (убедитесь, что Identity=100%) и нажмите кнопку "Show alignments".

AC записи EMBL CP000050 и координаты находки в этой записи 2324921-2325133.

У первой находки (CP000050) был выбран режим "Show Alignments". Была выдана следующая информация:

>EM_PRO:CP000050; CP000050 Xanthomonas campestris pv. campestris str. 8004,
            complete genome.
        Length = 5,148,708

  Plus Strand HSPs:

 Score = 1365 (210.9 bits), Expect = 1.5e-52, P = 1.5e-52
 Identities = 273/273 (100%), Positives = 273/273 (100%), Strand = Plus / Plus

Query:       1 ATGACCAAGTCCGAATTGATCGAAATCCTGGCGCGACGCCAAGCGCATCTGAAGTCGGAC 60
               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 2324861 ATGACCAAGTCCGAATTGATCGAAATCCTGGCGCGACGCCAAGCGCATCTGAAGTCGGAC 2324920

Query:      61 GATGTGGATCTGGCGGTCAAATCGCTGCTTGAAATGATGGGGCAGGCCTTGTCCGATGGT 120
               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 2324921 GATGTGGATCTGGCGGTCAAATCGCTGCTTGAAATGATGGGGCAGGCCTTGTCCGATGGT 2324980

Query:     121 GATCGGATCGAAATCCGTGGGTTTGGCAGCTTCTCGCTGCATTACCGCCCGCCACGCCTG 180
               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 2324981 GATCGGATCGAAATCCGTGGGTTTGGCAGCTTCTCGCTGCATTACCGCCCGCCACGCCTG 2325040

Query:     181 GGCCGCAACCCGAAGACCGGTGAATCGGTCGCGCTGCCTGGCAAGCATGTTCCGCATTTC 240
               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 2325041 GGCCGCAACCCGAAGACCGGTGAATCGGTCGCGCTGCCTGGCAAGCATGTTCCGCATTTC 2325100

Query:     241 AAACCCGGCAAGGAGCTGCGCGAGCGCGTGAGC 273
               |||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 2325101 AAACCCGGCAAGGAGCTGCGCGAGCGCGTGAGC 2325133

Полная запись EMBL получена с помощью команды: entret embl:CP000050 -auto

Информация о поле FT в полной записи:

FT   CDS             2324861..2325172
FT                   /codon_start=1
FT                   /transl_table=11
FT                   /locus_tag="XC_1925"
FT                   /product="integration host factor beta subunit"
FT                   /db_xref="GOA:Q4UVD5"
FT                   /db_xref="HSSP:1B8Z"
FT                   /db_xref="InterPro:IPR000119"
FT                   /db_xref="InterPro:IPR005685"
FT                   /db_xref="InterPro:IPR010992"
FT                   /db_xref="InterPro:IPR020816"
FT                   /db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:Q4UVD5"
FT                   /protein_id="AAY48988.1"
FT                   /translation="MTKSELIEILARRQAHLKSDDVDLAVKSLLEMMGQALSDGDRIEI
FT                   RGFGSFSLHYRPPRLGRNPKTGESVALPGKHVPHFKPGKELRERVSSVVPVDMVDAAD"

Координаты CDS: 2324861..2325172
Участок соответствует записи банка UniProt: Q4UVD5

Поиск гомологов с помощью программы BLASTN

Выбрана запись X04864 (из прошлого задания "Банк нуклеотидных последовательностей EMBL" из табл. "Характеристика записей EMBL, на которые ссылается запись P0A6Y1 банка SwissProt")

Запись сохранена с помощью команды:


entret embl:X04864 -auto

Координаты в записи CDS: 1..600

Кодирующая последавательность была вырезана в файл:

seqret "embl:X04864[1:600]" X04864.fasta

Файл: X04864.fasta

Поиск гомологов гена в геноме Xanthomonas campestris программой BLASTN

Запущены следующие команды:

     blastall -p blastn -d xc -i X04864.fasta -e 10 > X04864.out

E-value вводил 10, т.к при 0.001 гомологов не находил. Выходной файл: X04864.out


Характеристика лучшей находки:E-value <10
	E-value находки	0.010
	Название геномной последовательности	>AE012243 AE008922 Xanthomonas campestris pv. campestris str.
	Координаты выравнивания(-ий) в найденной последовательности	8754-8772

blastn не нашел ничего соответствующего находке tblastn. Длина выравнивания больше, а E-value меньше в tblastn. tblastn лучше подходит для поиска гомологов, чем blastn.

9.1 Работа с программой getorf пакета EMBOSS

Получил файл с записью D89965 банка EMBL d89965.entret :

entret embl:d89965

Была запущена программа getorf, чтобы получить набор трансляций всех открытых рамок (длиной более 30 нуклеотидов, считая открытой рамкой последовательность триплетов, начинающуюся со старт-кодона и заканчивающуюся стоп-кодоном, при использовании бактериального кода)
Была выполнена следующая команда:

   
    getorf -minsize 30 -find 1 -table 11
    Finds and extracts open reading frames (ORFs)
    Input nucleotide sequence(s): d89965.entert
    protein output sequence(s) [d89965.orf]:
  

Получил файл: d89965.orf
Наиболее соответствующая записи D89965 открытая рамка считывания 5:

>D89965_5 [19 - 432] Rattus norvegicus mRNA for RSS complete cds.
MVFWLHHVTVTGDDKRCSFIRDCQQCFKFAQHAIGTPVFCQLNGGFDQMALMHFQFTFKQ
FEQRKSIRSTARKARDDFVVVQTADLFHVAFHYGIAQRGLTITSDDHMAVTAYAYYSCHE
LTPWLRIQSTNPVQKYGA  


Получил файл с записью Swiss-Prot: entret sw:P0A7B8
Выходной файл: hslv_ecoli.entret При помощи программы BLASTP было найдено, что записи hslv_ecoli.entret банка Swiss-Prot соответствует 13 рамка

>sp|P0A7B8.2|HSLV_ECOLI  RecName: Full=ATP-dependent protease hslV; AltName: Full=Heat 
Length=176

 Score =  254 bits (648),  Expect = 1e-67, Method: Compositional matrix adjust.
 Identities = 125/125 (100%), Positives = 125/125 (100%), Gaps = 0/125 (0%)

Query  2    MTTIVSVRRNGHVVIAGDGQATLGNTVMKGNVKKVRRLYNDKVIAGFAGGTADAFTLFEL  61
            MTTIVSVRRNGHVVIAGDGQATLGNTVMKGNVKKVRRLYNDKVIAGFAGGTADAFTLFEL
Sbjct  1    MTTIVSVRRNGHVVIAGDGQATLGNTVMKGNVKKVRRLYNDKVIAGFAGGTADAFTLFEL  60

Query  62   FERKLEMHQGHLVKAAVELAKDWRTDRMLRKLEALLAVADETASLIITGNGDVVQPENDL  121
            FERKLEMHQGHLVKAAVELAKDWRTDRMLRKLEALLAVADETASLIITGNGDVVQPENDL
Sbjct  61   FERKLEMHQGHLVKAAVELAKDWRTDRMLRKLEALLAVADETASLIITGNGDVVQPENDL  120

Query  122  IAIGS  126
            IAIGS
Sbjct  121  IAIGS  125

9.2 Поиск некодирующих последовательностей программой BLASTN

Задача- определить, сколько гомологов каждой из тРНК находит программа BLASTN в геноме родственной бактерии Xanthomonas campestris

1 Я запустил blastn и в качестве последовательности для поиска указал trna_ecoli.fasta , а в качестве банка- геном бактерии проиндексированный

 blastall -p blastn -d xc -i trna_ecoli.fasta -m 8 > trna_ecoli.txt

2 Создал колонку из названий входных последовательностей командой

grep ">" trna_ecoli.fasta

3 Создал скрипт из команд, выдающих число находок для каждой последовательности

(чтобы сделать файл со скриптом исполняемым:chmod +x script.scr
и можно его запускать: ./script.scr)


(scripit) (выходной файл: blastn.txt)

Сделала тоже самое для E-value<0.001

9.3 Поиск некодирующих последовательностей программой megablast

Поиск программами megablast и discontigous megablast. Команды:

megablast -D 2 -m 9 -o trna_ecoliM.txt -d xc -i trna_ecoli.fasta
megablast -D 2 -m 9 -W 11 -t 16 -N 1 -o trna_ecolidm.txt -d xc -i trna_ecoli.fasta

Параметры:

 
-D - вид выходного файла. значение 2 - стандартная выдача
-t - длина поискового слова, с учетом "разрывов".
Может принимать значения 16, 18, 21.
Выбрано 16
-W - длина поискового слова, без учета "разрывов"
Может принимать значения 11 или 12
Выбрано 11
-N - тип поисковых слов.
0 - для поиска по кодирующим последовательностям.
1 - для поиска по некодирующим последовательностям.
2 - и по тем, и по другим.
Выбрано значение 1, так как поиск ведется по некодирующим последовательностям. 

Отчетный Excel-файл trna.xlsx

Анализ результатов

Выбрал пару из tRNA E.coli и найденного в геноме другой бактерии гомологичного участка.
При поиске гомологичных участков в геноме Xanthomonas campestris из тРНК metY программой
BLASTN находится последовательность AE012363, а поиск программой megablast результатов не дает
(т.к. blastn ищет по рамкам длины 11, а megablast ищет слова длины 28).

Выравнивание в BLASTN:

>AE012363 AE008922 Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC
           33913,  section 271 of 460 of the complete genome.
          Length = 8145

 Score = 95.6 bits (48), Expect = 5e-21
 Identities = 69/76 (90%)
 Strand = Plus / Minus

                                                                       
Query: 2   gcggggtggagcagcctggtagctcgtcgggctcataacccgaagatcgtcggttcaaat 61
           |||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||| |||  |||||||||
Sbjct: 205 gcggggtggagcagtctggcagctcgtcgggctcataacccgaaggtcgcaggttcaaat 146

                           
Query: 62  ccggcccccgcaacca 77
           || |||||||| ||||
Sbjct: 145 cctgcccccgctacca 130

Гомологичный участок AE012363 был вырезан в отдельный файл с помощью команды:

seqret -sask
Reads and writes (returns) sequences
Input (gapped) sequence(s): xc_genome.fasta:AE012363
Begin at position [start]: 130
End at position [end]: 205
Reverse strand [N]: Y
output sequence(s) [ae012363.fasta]: metY.fasta

Выходной файл: matY.fasta
Аналогичным образом была получена исходная последовательность тРНК trnamety.fasta
С помощью программы needle было получено выравнивание этих последовательностей:

# Aligned_sequences: 2
# 1: AE012363
# 2: metY
# Matrix: EDNAFULL
# Gap_penalty: 10.0
# Extend_penalty: 0.5
#
# Length: 77
# Identity:      69/77 (89.6%)
# Similarity:    69/77 (89.6%)
# Gaps:           1/77 ( 1.3%)
# Score: 317.0
#
#
#=======================================

AE012363           1 -gcggggtggagcagtctggcagctcgtcgggctcataacccgaaggtcg     49
                      ||||||||||||||.||||.|||||||||||||||||||||||||.|||
metY               1 cgcggggtggagcagcctggtagctcgtcgggctcataacccgaagatcg     50

AE012363          50 caggttcaaatcctgcccccgctacca     76
                     ..|||||||||||.||||||||.||||
metY              51 tcggttcaaatccggcccccgcaacca     77

Запись AE012363 EMBL:

FT   tRNA            complement(130..206)
FT                   /gene="XCC2514"
FT                   /product="tRNA-Met"
FT                   /note="Found by tRNAscan"