Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.su/FBB/year_02/science_1/Anna.doc Дата изменения: Tue Nov 18 17:41:02 2003 Дата индексирования: Mon Oct 1 22:08:15 2012 Кодировка: koi8-r

Сопоставление теоретических и экспериментальных данных по структурам LH-2
комплексов пурпурных бактерий.

Студентка 1-го курса Факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им.М.В.
Ломоносова Никулова Анна ( тьютор - А.Ю. Борисов). 2003 г.


В данной работе было проведено сравнение рассчитанных
теоретически и экспериментально измеренных времен передачи ЭВС в белково-
пигментном комплексе LH-2 пурпурных бактерий (на примере Rhodopseudomonas
acidophila). Полученные теоретические данные существенно разошлись с
экспериментальными. Возможные причины такого расхождения анализируются в
данной работе.


Введение.


Полна чудес могучая природа.
Из оперы Римского-Корсаковa «Снегурочка».

Одним из важнейших процессов, обеспечивающих жизнь на Земле,
несомненно, является фотосинтез - процесс преобразования энергии солнечного
света в энергию химических связей органических веществ, происходящий с
участием поглощающих свет пигментов (хлорофиллов a, b, c, d,
бактериохлорофиллов, каротиноидов и некоторых других). Это единственный
биологический процесс, который идет с увеличением свободной энергии и прямо
или косвенно обеспечивает доступной химической энергией все живые организмы
(кроме хемосинтетиков).
Значение фотосинтеза огромно. Ежегодно в результате фотосинтеза
образуется около 150 миллиардов тонн органического вещества, усваивается
порядка 300 млрд. т. углекислого газа и выделяется примерно 200 млрд. т.
свободного кислорода. Фотосинтез способствовал появлению атмосферы,
возникновению озонового экрана, защищающего Землю от ультрафиолетового
излучения и парникового эффекта, и созданию условий для биологической
эволюции. Наконец, все существующее благодаря этому, активно используется
человеком в различных целях: создается ряд полезных материалов (древесина,
каучук, смолы, фибра), лекарственные вещества, красители, пищевые продукты
и многое-многое другое. А свежий воздух и красивая природа нужны сейчас
всем людям, зачастую находящимся в стрессовой обстановке. Для человечества
фотосинтез важен еще и потому, что изучение процессов поглощения и
трансформации энергии света, возможно, позволит в будущем использовать
сходные механизмы для более полной реализации солнечной энергии.
Надо заметить, что все, сказанное выше, относится в большей
степени к оксигенному фотосинтезу, осуществляемому высшими растениями,
водорослями и цианобактериями. В оксигенном фотосинтезе используется два
различных фотохимических аппарата - фотосистема-1 и фотосистема-2.
Неоксигенные фотосинтетические бактерии имеют только одну фотосистему,
поэтому кислород не выделяется. Но зато из-за относительно простой
организации фотосинтетического аппарата этих организмов, они являются
очень удобным объектом для исследования первичных процессов фотосинтеза.

Фотопреобразующий аппарат фотосинтеза располагается в тонких (40-
50е) мембранах /1/. Доля светопоглощающих пигментов в них составляет 3-5%.
Мембрана представляет собой двойной слой из липидов, имеющих полярные
гидрофильные головки, направленные наружу, и длинные неполярные
углеводородные цепи, которые благодаря гидрофобному взаимодействию обращены
вовнутрь мембран. Липидный бислой пронизан трансмембранными белками,
наружные части которых гидрофильны, а внутримембранные представлены (- и (-
спиралями, образованными в основном алифатическими и неполярными
аминокислотами.
Организация фотосинтетического аппарата наиболее хорошо изучена у
класса пурпурных бактерий. Фотосинтетическая единица (ФЕ) у них
представлена реакционным центром (РЦ), окружающим его «коре»-комплексом LH-
1 и несколькими адаптивными комплексами LH-2, количество которых может
меняться вплоть до 8-10, в зависимости от интенсивности освещения и
температуры /2,3/. Для этих комплексов характерны различные положения
длинноволновых полос поглощения, причем основной комплекс LH-1 (полоса
около 880нм) имеет наименьшую энергию электронных возбужденных состояний
(ЭВС), что обеспечивает активный «сток» на него ЭВС от более
высокоэнергетических (и, соответственно, коротковолновых) комплексов LH-2.
LH-2 представляет собой 8-9 (/(-гетеропар мембранных полипептидов,
симметрично расположенных по кругу внутри липидной мембраны.
Гетеродимер,
|[pic] |состоящий из пары (- и (-белковых |
|Рис.1.Хлорофилл а |спиралей, связывает 1 молекулу Бхл-а с |
|(принцип строения такой |полосой поглощения при 800нм (В800), 2|
|же, как и у БХла). |молекулы БХл-а с полосой при 850нм |
| |(В850) и 1 молекулу каротиноида. БХл |
| |образует 2 кольца: периплазматическое из|
| |16 молекул В850 и цитоплазматическое из|
| |8 молекул В800. Основу самой молекулы |
| |БХл-а составляет кольцо из 4 пирролов |
| |(пятичленных азотсодержащих циклических |
| |соединений), связанных ионом магния |
| |(рис.1). Диполь молекулы направлен от |
| |азота третьего пиррола к азоту первого. |
| |Солнечное излучение поглощают все |
| |элементы ФЕ, однако ЭВС, возникающим в |
| |LH-2, необходимо пройти заметно больший |
| |путь, чем возбужденным непосредственно в|
| |РЦ или в LH-1. Было экспериментально |
| |доказано, что у представителей мира |
| |фотосинтеза миграция |


энергии генерируемых светом ЭВС происходит по возбужденным синглетным
уровням (S1*) антенных молекул механизмами электромагнитной индукции /4/
(см. также обзор /5/). Они включают как «медленный» индуктивно-резонансный
перенос ЭВС от возбужденной молекулы к находящейся поблизости
невозбужденной молекуле (или агрегату из нескольких молекул), так и
наиболее быстрый экситонный механизм, при котором ЭВС делокализуется по
нескольким сближенным молекулам /5/. Время жизни ЭВС у молекул красителей
весьма короткое ((1 нс). Поэтому для реализации высокого квантового выхода
необходимо было создать такие условия, чтобы времена перескоков ЭВС между
молекулами были значительно меньшими - порядка пикосекунды.
У всех исследованных к настоящему времени антенных комплексов
хлорофиллов (Хл) и бактериохлорофиллов (БХл) были обнаружены «узкие
места» - межмолекулярные промежутки от 15 до 30е на пути ЭВС к РЦ.
Очевидно, что эти размеры значительно больше длины дипольных переходных
моментов молекул БХл и Хл, следовательно энергия взаимодействия столь
удаленных молекул составляет менее 1 мэВ и миграция ЭВС через такие
промежутки требует времен около 5-10 пс, за которые возбужденные молекулы
успевают перейти в квазиравновесное состояние. Понятно, что эти промежутки
вносят основной вклад в величину среднего времени доставки ЭВС от антенны
на РЦ и пропорциональное ему значение квантовых потерь на этом пути. Кроме
того, в «узких местах» выполняются все требования, предъявляемые теорией
индуктивного резонанса Ферстера /6/. Поэтому в настоящей работе анализ
современной модели первичных процессов фотосинтеза проводится на ее
основе.
В теории индуктивного резонанса вводится важный параметр -
критическое расстояние (R0) между возбужденной молекулой-донором (D*) и
невозбужденной молекулой-акцептором (A), усредненного по всем возможным
взаимным ориентациям диполей этих молекул /6/. При расстоянии между D* и
A, равном R0, константа скорости (КD,A) миграции ЭВС между ними (D*+ A (
КD,A (D + A*) по определению равняется сумме констант скоростей
тривиальных процессов внутримолекулярной деактивации ЭВС в ансамбле
возбужденных молекул донора (флуоресценции, конверсии в триплеты и потерь в
тепло).
При произвольном расстоянии (R) между молекулами А и D (однако в
диапазоне его значений, в котором выполняются вышеперечисленные требования
теории Ферстера) интересующая нас величина константы скорости
межмолекулярного переноса ЭВС пропорциональна выражению:

?(?,?,?)2
КD,A = (tD,A) -1 ~ (R0/R)6 ? FD(?) ?A(?) ?-
4 d? (1)
?D n4

где: tD,A - среднее время переноса ЭВС от молекул D* к молекулам А; n -
коэффициент преломления света, квадрат которого в диапазоне оптических
частот равен коэффициенту диэлектрической поляризации в окружающей молекулы
среде; FD(?) - нормированный спектр флуоресценции донора; (A(?) - спектр
абсорбции молекул акцептора; ?D - время жизни ЭВС в молекулах D* в
отсутствии молекул акцептора ( FD(?)/?D ~ ?D(?-?St) ) или их радиационное
время жизни; ? и ?St - оптическая частота и Стоксов сдвиг в см-1;
интеграл берется в области перекрытия полос FD(?) и ?A(?),
соответствующих синглетным переходам в 1-ое возбужденное состояние, S0(S1(;
?(?,?,?)2 - фактор взаимной ориентации диполей A( и D(, равный /6/:
?(?,?,?)2 = [cos? - 3 cos? cos?]2,
(2)

?, ?, ? - углы в трехмерном пространстве, задающие взаимное положение
дипольных моментов молекул донора и акцептора ЭВС.
При R = R0, по определению: КD,A= (?D)-1 и ?(?,?,?)2 = 2/3.
Подставив эти три равенства в формулу (1) и разделив ее почленно на
исходную (1), получим:
?(?,?,?)2
?D / tD,A = (R0 /
R)6. (3)
2/3

Согласно данным работ /7,5/ для БХл-а имеем: при ?D = 18 нс и
?(?,?,?)2 = 2/3, R0 = 80 е . Но данное критическое расстояние было найдено
для передачи ЭВС между гомогенными молекулами при длине волны 870 нм. В
данной же работе рассматривается миграция между гетерогенными молекулами
(В800 и В850), причем середина диапазона длин волн находится около 825 нм.
Поэтому для более точного вычисления времени переноса ЭВС необходимо
использовать не R0, а hetR0(825) - критическое расстояние гетерогенной
миграции между молекулами с полосами поглощения около 800 и 850.
Определение величины hetR0 проведено в два этапа. Сначала была
найдена величина R0(825) для условной гомогенной миграции между молекулами
БХл-а на частоте, соответствующей 825 нм. Для этого: а) в формуле (1) ?-4
(среднее) выносится за интеграл (в силу того, что полоса абсорбции
достаточно узка, и ее полуширина составляет не более 3% от частоты в пике,
это дает небольшую ошибку); б) формула (1) записывается дважды: для ?,
соответствующей 870 нм, и R0(870) = 80 е и для ?, соответствующей 825 нм,
и R0(825); деля эти выражения одно на другое, получаем:

[R0(825)/ R0(870)]6 = (825/870)4 —
0.808.

Затем, чтобы учесть фактор гетерогенности, аналогичным способом находится
отношение:

[ hetR0(825)/R0(825) ]6 = hetI/I —
0.669,

где I и hetI - интегралы ? FD(?) ?A(?) ?-4 d? для случаев гомогенной и
гетерогенной миграций соответственно. Для вычисления этого отношения за
основу был взят спектр поглощения хлорофилла а в ацетоне, который по форме
очень близок к спектру поглощения БХл-а in vivo.
Таким образом, получаем:

hetR0(825)6= (825/870)4 * ( hetI/I) * R0(870)6 —
R0(870)6 *0.54.

Из формулы (1) видно, что для эффективного переноса ЭВС к РЦ
нужно максимально сблизить молекулы Бхл-а, но так, чтобы они еще не
образовывали ассоциаты. Подобные структуры обеспечивают специфичные
мембранные белки. Молекулы хлорофилла присоединяются к гистидиновым
аминокислотам белков атомами Mg, расположенными в центре тетрапирольных
хромофоров. Низкая диэлектрическая проницаемость мембраны благодаря
неполярности углеводородных хвостов липидов и белков также способствует
быстрой передаче ЭВС. Важными факторами являются и поглощательная
способность молекул и их близость к резонансу. А сильно влияющая на
константу скорости частота поглощаемого излучения, входящая в формулу в 4
степени, мала по сравнению с другими красителями (для БХл-а порядка
3.75*1014 c-1).
Таким образом, Природа создала почти оптимальные условия для
эффективной миграции ЭВС от массы «антенных» хромофоров на РЦ.

Постановка задачи.

В 1997 году были получены точные сведения о расположении молекул в
LH-2 комплексе бактерии Rhodopseudomonas acidophila /4/. Экспериментальные
данные показывают, что передача ЭВС от молекул В800 к молекулам В850
происходит примерно за 0.8 пс /8/. Для анализа адекватности этих данных
нашим представлениям о скоростях и механизмах передачи ЭВС внутри
комплексов LH-2 (и от них к LH-1) необходимо сравнить теоретические
величины средних времен доставки энергии ЭВС к РЦ с экспериментальными. Для
решения этой задачи в настоящей работе требовалось установить расстояния
между поглощающими свет молекулами (конкретно, одной из В800 и семью
ближайшими к ней В850) и взаимное положение их диполей. Знание этих
структурных параметров должно позволить рассчитать времена миграции ЭВC к
РЦ с помощью теории Ферстера /6/.
Совпадение теоретических расчетов (с определенной точностью) с
экспериментальными величинами могло бы считаться как подтверждением
близости кристаллической структуры комплекса LH-2 к таковой in vivo, так и
еще одним доказательством теории Ферстера.
Если же теоретические и экспериментальные результаты сильно
разойдутся, то, вероятнее всего, ошибку следует искать в измерениях времен
миграции ЭВС, в несоответствии структуры фотосинтетического аппарата в
кристаллизованном виде и in vivo или в специфическом влиянии каротиноидов
на перенос энергии.

Материалы и методы.
|Рассматриваемая |[pic] |
|структура LH2 комплекса | |
|и ее восстановленный | |
|вариант были взяты в | |
|Brookhaven protein bank | |
|(http://www.rcsb.org/pdb| |
|/, идентификационный | |
|номер 1LGH) и PQS банке | |
|(pqs.ebi.ac.uk, | |
|идентификационный номер)| |
|соответственно. | |
|Необходимые расстояния и| |
|углы измерялись при | |
|помощи программы RasMol,| |
|для обработки полученных| |
|результатов | |
|использовалась программа| |
|Microsoft Excel. | |
| |Рис.2. Изображение участка LH-2 |
| |комплекса бактерии Rhodopseudomonas |
| |acidophila. Молекула В800 (в нижнем |
| |ряду) помечена цифрой 1, а В850 (в |
| |вернем ряду) - цифрами 1,.,6. |


Результаты.

Были измерены расстояния между центрами одного из хромофоров
цитоплазматического кольца (В800) и 7 ближайших молекул периплазматического
кольца (В850) (центрами хромофоров считали атом магния у молекул БХл), а
также углы, необходимые для расчета ориентационного фактора: ? и ? - углы
между соответствующими диполями и прямой, соединяющей их центры; ? - угол
между самими диполями:

Таблица 1. Значения углов и расстояния между диполями молекулы В800 и
ближайшими молекулами
850.

|B850 |cos? |cos? |cos? |?(?,?,?)|R |
| | | | |2 | |
|1 |0.708 |0.581 |0.325 |0.826 |39.12 |
|2 |0.656 |0.502 |0.560 |0.182 |32.43 |
|3 |0.512 |0.741 |0.856 |0.080 |25.49 |
|4 |0.198 |0.327 |0.976 |0.611 |20.11 |
|5 |0.175 |0.040 |0.877 |0.733 |19.02 |
|6 |0.427 |0.624 |0.835 |0.001 |22.93 |
|7 |0.402 |0.717 |0.369 |0.246 |29.00 |

Данные в таблице приведены (сверху вниз) для семи пар взаимодействующих
молекул: одной, В800, из цитоплазматического кольца и ближайшими к ней из
периплазматического (рис.2). Более отдаленные хлорофиллы можно не
рассматривать из-за значительной зависимости времени передачи ЭВС от
расстояния (R-6).
На основе полученных результатов можно рассчитать, используя
формулу (3), константы скоростей миграции ЭВС для каждой из рассматриваемых
пар (КD,A i , i = 1,...,7), а затем - среднее время переноса возбуждения,
равное обратной сумме этих констант.

Таблица 2. Константы скорости и время переноса ЭВС.
|KD,A 1|KD,A 2|KD,A 3|KD,A 4|KD,A 5|KD,A |KD,A7|K? |tD,A, |
| | | | | |6 | | |нс |
|2.718 |1.846 |3.440 |108.97|182.63|0.081|4.879|304.57|0.00328|
| | | |4 |9 | | |7 | |


Обсуждение результатов и выводы.

Итак, среднее время миграции получилось равным —3.28 пс, что примерно в
четыре раза превышает экспериментальное значение —0.8 пс /5/. Такое
расхождение экспериментальных и рассчетных данных по среднему времени
переноса ЭВC от кольца молекул В800 к кольцу В850 во вспомогательных
комплексах LH-2 из пурпурных бактерий Rhodopseudomonas acidophila не может
игнорироваться. Проанализируем его возможные причины.
Адекватность использованной теории. Известен ряд критериев для
законного применения теории Ферстера /6/. А) Расстояние между диполями
должно быть существенно большим, чем длины этих диполей. По-видимому, >17
е этому требованию удовлетворяют, тем более что расположение плоскостей
молекул В800 параллельно плоскости мембраны существенно удаляет их
электроны от таковых у В850, что позволяет пренебречь обменными
взаимодействиями. Б) Время перехода возбужденных молекул В800 в
квазиравновесное состояние должно быть существенно меньшим чем среднее
время миграции ЭВC из них.
Параметры для определения величины R. R - важнейший и наиболее
критичный параметр для миграции c В800( на В850. В данной работе он был
рассчитан на основе классических данных работы /7/, в которой R0 = 80 е.
Величины же FD(?)/?D ~ ?D(?) и ?А(?), по данным /9/, весьма консервативны
для БХл-а: в 14-ти различных растворителях они изменялись в пределах 5%.
Изменение структуры LH-2. Изменение условий во внешней среде, в
частности электрических полей, и характера взаимодействий внутри отдельных
LH-2-комплексов несомненно способны вызвать изменение конформаций при
кристаллизации. По нашему мнению, можно ожидать значительное изменение
конформации LH-2 в условиях активного фотосинтеза в ответ на генерацию
светом электрической составляющей мембранного потенциала. Кулоновское
притяжение зарядов на противоположных сторонах мембраны, по-видимому,
способно вызвать эффект локальной электрострикции и изменить «световую»
конформацию по сравнению с «темновой».
Участие каротиноидов в переносе ЭВ. Согласно данным из Brookhaven
protein bank минимальные расстояния между ?-электронными системами молекул
В800 и каротиноидов и В850 и каротиноидов составляют всего 4-5 е. В рамках
теории Ферстера /6/ молекулы встроенных в LH-2 каротиноидов с их
способными к быстрой поляризации ?-электронными системами могут лишь
увеличить среднее микрозначение коэффициента диэлектрической поляризации.
Однако следует также проанализировать, не могут ли каротиноиды выступать в
роли ?-электронных «проводников тока», что снизило бы величину
эффективного расстояния между молекулами В800 и В850 и таким образом
устранило бы возникшее противоречие.


Цитированная литература.

1. Рубин АБ (1987) Биофизика т. 2, издат. Высшая школа, С 6-20, Москва.
2. Borisov AY (1989) Transfer of excitation energy in photosynthesis. Some
thoughts.
Photosynth. Res. 20: 35-58.
3. Fleming G.R. and van Grondelle R. (1997) Current Opinion in Structural
Biology, 7:
738-748.
4. Duysens LMN (1953) Thesis, Utrecht.
5. Van Grondelle R., Dekker J.P., Gilbro T., Sundstrem V. (1994) Biochim.
Biophys.
Acta. 1187: 1-65.
6. Агранович В.М., Галанин М.Д. (1978) Перенос энергии электронного
возбуждения в конденсированных средах, Москва, Наука.
7. Zankel K.L., Reed D.W., Clayton R.K. (1968) Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
61: 1243-
1249.
8. Ma Y-Z, Cogdell RJ, Gillbro T: Energy transfer and exciton annihilation
in the B800-
850 antenna complex of the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas
acidophila
(station 10050). A transient femtosecond absorption study. J Phys Chem B
1997, 101:
1087-1095.
9. Connolly J.S., Samuel E.B., Janzen A.F. (1982) Photochem. Photobiol. 36:
565-574.