Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.su/FBB/year_02/science_1/GalimovEugene.doc Дата изменения: Tue Nov 18 19:29:43 2003 Дата индексирования: Mon Oct 1 23:00:56 2012 Кодировка: koi8-r

Московский государственный университет
Поиск белков, с одночастичным сигналом ядерной локализации, расщепляемых
каспазами при апоптозе.


Галимов Евгений Рафаэлевич


студент 2-ого курса факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ


Научный руководитель: аспирант первого года


обучения Химического факультета МГУ Филонов Г.С.



Оглавление

1. Введение 3
2. Обзор литературы 4
2.1. Апоптоз 4
2.2. Каспазы 5
2.3. Сигналы ядерной локализации (NLS, nuclear localization signal) 9
3. Результаты и обсуждение 11
Анализ гомологов 13
Анализ третичной структуры 16
4. Экспериментальная часть 19
5. Выводы 20
6. Список литературы 21

1. Введение

Стремительное развитие компьютерных баз данных, содержащих информацию о
белках и геномах, а также биоинформатических методов анализа и поиска по
этим базам позволяет успешно решать различные биологические задачи не
прибегая к эксперименту. К примеру, в появившейся недавно работе
исключительно биоинформатическими методами были полностью реконструированы
и описаны пути биосинтеза рибофлавина, биотина, тиамина и кобаламина, а
также системы их регуляции у большого числа микроорганизмов [1].
Данная работа посвящена поиску биоинформатическими методами субстратов
каспаз 2, 3, 7 (ключевых ферментов апоптоза). Поиск осуществлен с помощью
модельной последовательности, отвечающей месту расщепления белка каспазами
и находящейся вблизи него специфической последовательности положительно
заряженных аминокислотных остатков, соответствующей классическому
одночастичному сигналу ядерной локализации.

2. Обзор литературы


2.1. Апоптоз

У многоклеточных организмов - животных, растений и грибов - генетически
заложена программа гибели клеток. Формообразовательные процессы в
онтогенезе, позитивная и негативная селекция Т- и В-лимфоцитов,
гиперчувствительный ответ растений на вторжение патогена, осенний листопад
- лишь несколько примеров программируемой клеточной смерти [2]. Эволюционно
программируемая клеточная смерть (апоптоз) возникла у прокариот как
механизм противовирусной защиты популяций и был закреплен у одноклеточных
эукариот. В дальнейшем, с появлением многоклеточных организмов, механизм
совершенствовался и был приспособлен, наряду с защитой от патогенов, для
реализации важных жизненных функций - дифференцировки клеток и тканей при
эмбриогенезе и постэмбриональном развитии, элиминирования клеток иммунной
системы, невостребованных, состарившихся клеток либо клеток, подвергшихся
воздействию мутагенных факторов. Апоптоз у животных и человека стал
неотъемлемым инструментом для осуществления наследственного и
приобретенного, гуморального и клеточного ответа иммунной системы [4].
В клетке существуют системы запускающие и предотвращающие апоптоз. Они
находятся в постоянном противодействии и стимулируются соответствующими
факторами-индукторами и факторами-ингибиторами апоптоза.
Среди стимулов, запускающих апоптоз можно выделить неспецифические
факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные
радикалы, ?- и УФ-излучение, вирусные инфекции, бактериальные токсины и др.
и специфические факторы, определяющие апоптоз как физиологическое явление.
Специфические факторы можно в свою очередь разделить на внутриклеточные
сигналы, являющиеся следствием нарушений процессов жизнедеятельности в
клетке, и внешние сигналы, опосредующие свое действие через рецепторные
системы - различные гормоны, белки-антагонисты Bax (индуктор) и Bcl-2
(ингибитор), цитокины, семейство фактора некроза опухоли [3].
Морфологически апоптоз выглядит следующим образом:
Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденсированными
областями (гетеро- и эухроматин), становится сверхконденсированным в форме
полумесяца по периферии ядра. Видны разрывы нитей ядерной ДНК. Сама клетка
сморщивается, теряя до 1/3 своего объема за несколько минут. При этом
целостность мембран сохраняется. Затем следует специфическая фрагментация
ДНК, распад ядра на части, фрагментация клетки на мембранные везикулы с
внутриклеточным содержимым (апоптотические тельца), фагоцитируемые
макрофагами и соседними клетками [2-3].

2.2. Каспазы

Морфологические изменения, происходящие при апоптозе, обусловлены
большим количеством биохимических процессов, происходящих как на
поверхности клетки, так и внутри ее. На внешней стороне клеточной мембраны
концентрируются различные соединения (например, фосфатидилсерин),
провоцирующие узнавание апоптотической клетки фагоцитами. Внутри клетки
происходит деградация хромосомной ДНК и специфический протеолиз белков [2].
Расщепление белков осуществляется семейством специфических цистеиновых
протеаз, называемых каспазами, гидролизующих белки после остатка
аспарагиновой кислоты [2-3].
Объяснение последствий этого эндопротеолитического расщепления (
ключевой момент для нашего понимания программируемой клеточной смерти
клетки и других биологических процессов. Множество белков расщепляются как
"свидетели", только лишь потому что они содержат участок расщепления
каспазами. Некоторые белки-мишени, однако, имеют определенную функцию в
распространении процесса смерти клетки. Множество структурных и
регуляторных белков инактивируются каспазами, в то время как другие
субстраты могут быть активизированы. В большинстве случаев последствия
такой активации недостаточно изучены. Некоторые каспазные субстраты
регулируют ключевые морфологические изменения при апоптозе, другие (
действуют также как преобразователи и усилители, которые определяют порог
за которым начинаются необратимые изменения (или, другими словами, судьбу
клетки). На сегодняшний день известно более 280 различных каспазных
субстратов [5].
Во всех клетках каспазы синтезируются в виде зимогенов, которые
процессируются при апоптозе, образуя активный фермент [6]. Превращение
каспаз в активную форму - необратимый процесс, приводящий к апоптозу [2-3].

К настоящему времени в различных клетках млекопитающих обнаружено 13
каспаз, образующих ферментативный каскад. Каспазы разделяются на
инициаторные и эффекторные. Инициаторные каспазы (8, 9, 10) принимая сигнал
к апоптозу переходят в активную форму и активируют эффекторные каспазы (3,
6, 7) - основные исполнители апоптоза [6].
Эффекторные каспазы расщепляют белки, принадлежащие самым различным
белковым семействам. Среди них:
1)Ключевые структурные компоненты цитоскелета и ядра, белки
вовлеченные в филаментную организацию - их расщепление вызывает
сморщивние и распад клетки,
2) Белки, участвующие в клеточной коммуникации,
3) Белки, предотвращающие фрагментацию ДНК,
4) Белки, участвующие в деполяризации F-актина - запускают
мембранный блеббинг,
5) Некоторые белки метаболизма,
6) Белки, участвующие в передаче сигнала, протеинкиназы,
7) Факторы транскрипции,
8) Белки, участвующие в репликации и репарации ДНК (например
хеликазы, расщепление которых ведет конденсации хроматина),
9) Белки, участвующие транскрипции и сплайсинге [5].
В таблице 1 показаны белки, расщепляемые каспазами 3 и 7 в ходе
апоптоза, места расщепления и предполагаемый эффект (по материалам обзора
[5]).
Таблица 1. белки, расщепляемые каспазами 3 и 7 при апоптозе.

|Субстрат |Физиологическая функция |Участок |Результат |
| | |расщеплени|расщепления |
| | |я | |
|Регуляторы апоптоза |
|Bcl-2 |Ингибитор апоптоза |DAGD (34) | |
|Cтруктурные компоненты цитоскелета и ядра |
|Fodrin |Компонент кортикального |b-II-Fodri|Разрушение |
| |мембранного цитоскелета |n: DEVD |кортикального |
| | |(1457) |цитоскелета и |
| | | |возможно участие в |
|Lamin A |Белок ядерной оболочки | |мембранном |
| | |VEID (230)|блеб-бинге |
| | | |Разборка ядерной |
| | | |ламины |
|Белки, вовлеченные в регуляцию клеточного цикла и деления клеток |
|Prothymosin|Вовлечен в клеточное деление|3 |Расщепление |
|-a | |перекрыва-|предотвращает |
| | |ющих друг |ядерную локализацию,|
| | |друга |спо-собность |
| | |участ-ка:D|индуцировать |
| | |DEDDD-VD |деле-ние |
| | |(101) |аннулируется |
|Синтез расщепление и репарация ДНК |
|Acinus |Апоптотический индуктор |DELD |Конденсация |
| |конденсации хроматина |(1093) |хроматина |
|PARP-1 |Поли-АДФ-рибоза | | |
| |полимераза-1, вовлечена |DEVD (214)|Потеря |
| |врепарацию ДНК и экспрессию | |каталитической |
| |генов | |ак-тивности и |
| | | |возможное |
| | | |пред-отвращения |
| | | |уменьшения зап-аса |
| | | |АТФ, необходимого |
| | | |для апоптоза. |
|ДНК-связывающие и транскрипционные факторы |
|IkBa |Ингибитор NF-kB |DRHD (32) |Генерация ингибитора|
|AP-2a |Индуцирующий |DRHD (19) | |
| |транскрипционный фак-тор | |Уменьшение |
| | | |ДНК-связываю-щей |
| | | |активности |
|Синтез РНК и сплайсинг |
|U1-70-kDa |Компонент малого ядерного |DGPD (341)|Уменьшение |
|snRNP |рибонук-леопротеинового | |процессирова-ния РНК|
| |комплекса U1 | | |
|Ser/Thr-протеинкиназы |
|PKC d |Протеинкиназа С дельта |DMQD (329)|Активация |
| | | |проапоптотичес-кой |
| | | |киназы |
|G-сигнальные белки |
|Cdc42 |GTP-связывающий белок, |DLRD (121)|Анулирование |
| |проводящий сигнал выживания | |антиапопто-тической |
| |и контролирующий | |функции |
| |цитоскелетную архитектуру | | |
|Вирусные белки |
|p35 |Бациловирусный ингибитор |DQMD (87) |Расщепление |
| |каспаз | |необходимо для |
| | | |ингибирования каспаз|
| | | |пос-редством p35 |
|Протеиновые фосфотазы |
|PP2A |Протеиновая фосфатаза 2А |DEQD (218)|Каспазы расщепляют |
| | | |альфа-l-субъединицу |
| | | |pp2a, уменьшая его |
| | | |активность |


Существует несколько особенностей расщепления белков при апоптозе. Во-
первых, многие субстраты расщепляются позже и менее полно, чем остальные.
Во-вторых, некоторые субстраты могут расщепляться только в определенных
типах клеток. В третьих, субстраты могут различаются по сайтам расщепления
в различных типах клеток [6].
Сайты расщепления каспазой не всегда консервативны у различных видов.
Например, место узнавания каспазами у циклина, расщепляемого в течение
апоптоза в ооцитах Xenopus, не существует в гомологах, находящихся в
клетках млекопитающих. Некоторые белки, такие как DNase-X, содержат один
или более классических участков расщепления в их последовательностях.
Однако, они не расщепляются внутри апоптотических клеток несмотря на
массивную каспазную активацию. В некоторых случаях, первый разрез,
сделанный каспазами делает доступными дополнительные участки расщепления
для других типов протеаз [5].
Для многих идентифицированных субстратов функциональные последствия их
расщепления неизвестны и могут быть выведены только из их нормальных
функций. В других случаях роль каспазного расщепления может быть
экспериментально оценена экспрессией субстрата, имеющего мутацию в месте
расщепления каспазой или фрагмента белка полученного в результате
каспазного расщепления. Основываясь на высокой консервативности
апоптотического фенотипа, от червей до млекопитающих можно заключить, что
существует устойчивая группа ключевых субстратoв каспаз. Протеолиз этих
белков по-видимому ведет к стереотипным изменениям, которые мы называем
апоптоз [5].
Поиск субстратов каспаз может дать ответ, например, на следующие
вопросы:
. Cуществует ли ключевой смертельный субстрат?
. Какой минимальный набор белков должен быть расщеплен, чтобы
инициировать фенотипические признаки апоптоза?
. Как расщепление каспазных субстратов связано с другими клеточными
процессами, такими как удаление мертвых клеток, или возможно более
несвязанными процессами деления и дифференцировки клеток [5]?
Название каспаза происходит от англ. сaspase. C означает цистеиновые
(от Cys), aspase - протеазы расщепляющие после C-конца аспарагиновой
кислоты [7]. Каспазы имеют высокий процент совпадения аминокислотной
последовательности между собой, подобны по структуре и субстратной
специфичности [6].
Активный сайт осуществляющий гидролиз - QACXG образует первичный
карман (S1) для остатка аспарагина (положение P1 белка-субстрата). Другие
аминокислотные остатки образуют узнающий карман S2-S4, связывающий боковые
группы субстрата находящимися в положении P2-P4 (т.е. для узнавания и
расщепления важны четыре аминокислотных остатка P1-P4) [8].
Индивидуальные каспазы различаются по своей субстратной специфичности.
Существует три группы субстратной специфичности каспаз.
1) Каспазы 1, 4, 5 предпочитают большие гидрофобные остатки в P4
положении, подходящие например для вместительного S2-S4 кармана
каспазы-1. Оптимальная последовательность для расщепления WEXD.
2) Каспазы 2, 3, 7 предпочитают остаток аспарагиновой кислоты в P4
положении (который идеально соответствует небольшому S2-S4 карману
каспазы 3). Оптимальная последовательность для них DXXD.
3) Каспазы 6, 8, 9 меньше выражены в своих предпочтениях к P4-
локализованному аминокислотному остатку. Оптимальная
последовательность для них (L/V)EXD [7].
Этот участок как правило не входит в ?-спираль или ?-лист, а
присутствует в различного рода петлях и т.п., и для того чтобы он был
доступен для расщепления ферментом, этот тетрапептид должен находиться на
поверхности белковой глобулы. Еще одним условием взаимодействия является
отсутствие остатка пролина после остатка аспарагиновой кислоты, находящейся
в P1 положении, поскольку это вызывает излом во вторичной структуре белка.
В белковой молекуле может быть много мест, отвечающих
последовательности DXXD, поэтому, чтобы утверждать с большой уверенностью,
что этот участок находится на поверхности, нужно его искать рядом с более
сложной аминокислотной последовательностью, о которой известно, что она
задействована в белок-белковом взаимодействии и, следовательно, доступна
для этого взаимодействия. Такой последовательностью является консенсус
классического сигнала ядерной локализации.

2.3. Сигналы ядерной локализации (NLS, nuclear localization signal)

NLS - это аминокислотная последовательность в структуре белка,
необходимая и достаточная для его активного транспорта в ядро [9].
Клеточное ядро отделено от цитоплазмы двухмембранной оболочкой,
пронизанной ядерными порами - каналами, образованными сложно организованным
белковым комплексом. Небольшие белковые молекулы (<40 кДа) могут свободно
диффундировать через ядерную пору, тогда как более крупные белки
транспортируются через нее активно. Для этого они должны иметь сигнальную
последовательность, называемую сигналом ядерной локализации. В цитоплазме
NLS узнаётся специфичным к нему растворимым рецептором - импортином ?,
после чего импортин ? соединяется с импортином (. Получившийся тройной
комплекс транспортируется в цитоплазматическую часть ядерной поры, а затем
в ядро за счет взаимодействия с белковыми компонентами поры. После
попадания белка в ядро рецептор отсоединяется и белок высвобождается в
кариоплазму [9].
Впервые NLS был определен для большого T-антигена SV40. Оказалось, что
этот сигнал представлен последовательностью положительно заряженных
аминокислот 126PKKKRKV132 [10]. По-видимому этот сигнал ядерной локализации
структурно представлен ?-поворотом.
Следующим белком, для которого был показан такой сигнал, стал
нуклеоплазмин. Этот существующий в виде пентамера белок быстро
накапливается в ядре и построен из протеазо-устойчивой "головки" и
"хвоста". После обработки протеазами эти два домена разделяются, причем
"хвосты" сохраняют способность накапливаться в ядре, а "головки" ее теряют.
NLS нуклеоплазмина также содержал положительно заряженные аминокислоты, но
здесь они располагались двумя небольшими островками [10]. Участок между
островками положительно заряженных аминокислот называется спейсером. Он не
участвует в транспорте, а его длина колеблется от 10 до 40 аминокислотных
остатков [9].
На основании этих различий сигналы ядерной локализации подразделяют на
одночастичные (monopartite) и двучастичные (bipartite). NLS различных
белков не имеют значительной гомологии: единственное объединяющее их
свойство - это наличие участков расположенных последовательно положительно
заряженных аминокислот. Этот вид NLS получил название "классического" [10].
Классические одночастичные NLS представляют собой короткий пептид,
обогащённый положительно заряженными остатками: лизином и аргинином [9].
Сигналы ядерной локализации не отщепляются после поступления белка в
нуклеоплазму. Это отличает ядерный транспорт от, например, сигнала
транспорта в эндоплазматический ретикулум и другие органеллы. Такое отличие
может быть обусловлено несколькими причинами:
- Во-первых, NLS может располагаться не на конце, а в центре
полипептида и, поэтому, принимать участие в образовании активного
комплекса, например РНК- или ДНК-связывающего. Удаление сигнала в этом
случае может привести к потере функциональной активности.
- Во-вторых, некоторые ядерные белки постоянно перемещаются в
цитоплазму и реимпортируются в ядро.
- В-третьих, во время клеточного деления ядерная оболочка распадается и
собирается заново, а высвободившиеся ядерные белки должны быть снова
импортированы в новообразованное ядро [10].
* * *
Каспазы играют центральную роль в запуске и развитии апоптоза. Поиск
белков, являющихся мишенями каспаз несомненно перспективен для открытия
новых функций уже известных белков.
Важное условие функционирования NLS также как и места расщепления
каспазами - это доступность для белок-белкового взаимодействия, то есть
нахождение на поверхности белковой глобулы. Часто в молекуле белка бывает
несколько участков DXXD, что осложняет поиск новых субстратов каспаз по
этому тетрапептиду; в то же время короткая последовательность, обогащенная
остатками лизина и аргинина встречаются значительно реже. Если
предполагаемый NLS является действующим, то место расщепления каспазами,
находящееся вблизи него с высокой вероятностью тоже находится на
поверхности белка.

3. Результаты и обсуждение

1) Для поиска белков, расщепляемых каспазами 2, 3, 7, в компьютерных
базах данных мы создали критерий, основываясь на следующих положениях:
A. последовательностью расщепления для них является DXXD.
B. после последнего аспарагинового остатка не должен следовать
пролин, который вносит излом во вторичную структуру и тем самым
препятствует связыванию данного участка с ферментом.
Так как для взаимодействия с каспазой участок DXXD должен находиться на
поверхности белковой глобулы, мы решили искать его рядом с
последовательностью предполагаемого классического одночастичного сигнала
ядерной локализации. Чтобы увеличить вероятность существования NLS у белка,
решено было искать субстраты каспаз среди ядерных белков.
То есть мы искали ядерные белки, содержащие классический одночастичный
NLS и находящийся рядом с ним участок DXXD.
Для поиска по первичным структурам белков, отвечающих этим условиям,
нужно составить некую модель (или паттерн).
Классический одночастичный NLS не имеет единого консенсуса. Это участок,
обогащенный положительно заряженными аминокислотными остатками лизином и
аргинином. Поэтому, чтобы получить выборку, количество белков в которой
удобно изучать и анализировать, мы остановились на следующем мотиве:
[KR]-X(0,1)-[KR] -X(0,1)- [KR]- X(0,1)- [KR]- X(0,1) -[KR] -X(0,1)- [KR],

где
X(0,1) означает отсутствие или присутствие любого аминокислотного в
данном месте последовательности;
[KR] означает присутствие аминокислотного лизина или аргинина в данном
месте последовательности.
{P}- невозможность нахождения остатка пролина в этом положении.
По тем же соображениям мы решили искать участок, после которого идет
расщепление на расстоянии не более девяти аминокислотных остатков от
предполагаемого NLS.
Общий вид паттерна выглядит так:
D-X-X-D-{P} -X(0,9)-[KR]-X(0,1)-[KR] -X(0,1)- [KR]- X(0,1)- [KR]- X(0,1)
-[KR] -X(0,1)- [KR], когда место расщепления ищем слева от возможного NLS.
[KR]-X(0,1)-[KR] -X(0,1)- [KR]- X(0,1)- [KR]- X(0,1) -[KR] -X(0,1)- [KR]-
X(0,9)-D-X-X-D-{P} когда место расщепления ищем справа от возможного NLS.
D-X-X-D-{P} -X(0,9)-[KR]-X(0,1)-[KR] -X(0,1)- [KR]- X(0,1)- [KR]- X(0,1)
-[KR] -X(0,1)- [KR] -X(0,9)-D-X-X-D-{P}, когда место расщепления ищем с
обоих сторон от возможного NLS.

2) Поиск по базе первичных структур Swissprot с помощью вышеуказанных
паттернов средствами пакета программ EMBOSS дал 191 белок. 128 белков
соответствуют паттерну 1, 82 - паттерну 2, 11 - паттерну 3, 8 соответствует
паттернам 1 и 2, но не соответствует паттерну 3. Результаты представлены в
Таблице 1 (см. приложение - http://kodomo.cmm.msu.su/~gall/pril.doc).
Полученные белки можно разделить на следующие группы:
А) Факторы транскрипции
Б) Белки, участвующие в репликации и репарации ДНК
В) Белки, участвующие в транскрипции и сплайсинге
Г) Другие белки, исполняющие в клетке различные функции и которые сложно
четко классифицировать.
Подчеркнем, что эти группы белков, принадлежат к кругу известных типов
субстратов каспаз.
Среди полученных белков оказались несколько уже известных субстратов
каспаз, что является хорошим подтверждением удачного выбора паттерна.
Найденное с помощью предложенного метода место расщепления каспазами
(DEVDGIDEVTKKKSKKEK) совпало с местом, обнаруженным экспериментально у
белков семейства PARP (поли-АДФ-рибоза полимераза-1) ( DEVD.
У белков-факторов репликации ДНК MCM3 и у топоизомеразы-2 места
расщепления неизвестны, и мы можем на основании наших данных с некоторой
вероятностью их предположить. У белков семейства Acinus место расщепления
каспазами не совпало с найденным при помощи паттерна.

3) Нашей следующей задачей было предположить критерии для отбора белков,
наиболее перспективных для проверки экспериментальными методами. Итак, мы
получили 191 белок. Из них нужно выбрать наиболее вероятные субстраты
каспаз.

Анализ гомологов

Одним из критериев может служить факт попадания в выборку белков-
гомологов, что говорит о высокой вероятности консервативности у них
участка, соответствующего предполагаемому классическому одночастичному NLS,
и расположенному рядом с ним месту расщепления каспазами. При этом белки-
гомологи не должны совпадать по своей аминокислотной последовательности
более чем на 70 процентов иначе их можно считать идентичными, при этом
значимость консервативности участка, соответствующего паттерну теряется. Мы
рассматривали семейства содержащие 3 и более гомологов. Используя программу
множественных выравниваний ClustalW 1.75 мы сделали грубую оценку
консервативости белков принадлежащих этим семействам. И исключили те
семейства, в которых белки можно считать идентичными или не консервативны
участки соответствующие паттерну. Для белков оставшихся семейств мы сделали
полные попарные выравнивания программой Stretcher пакета программ EMBOSS.
Вместе с полным попарным выравниванием мы получили процент совпавших
аминокислотных остатков для каждых двух белков. Парные выравнивания этих
белков лежат по адресу:
http://kodomo.cmm.msu.su/~gall
Следующие семейства можно рассматривать как наиболее вероятные субстраты
каспаз:
. Белки спаренного Homeobox семейства ( факторы транскрипции зрительного
анализатора, регулирующих дифференциацию клеток сетчатки на ранних
стадиях (VSX1 ( мнемоническое название гомологов в Swissprot).
Таблица сходства:
| |Название вида |1 |2 |3 |4 |
|1 |Bos Taurus | |47.4 |46.8 |81.6 |
|2 |Brachydanio rerio |47.4 | |92.7 |49.2 |
|3 |Carassius auratus |46.8 |92.7 | |47.9 |
|1 |Gallus gallus | |70.8 |69.5 |63.0 |
|2 |Homo sapiens |70.8 | |79.0 |58.4 |
|3 |Mus musculus |69.5 |79.0 | |59.6 |
|1 |Gallus gallus | |64.9 |54.2 |25.6 |
|2 |Homo sapiens |64.9 | |73.5 |21.1 |
|3 |Mus musculus |54.2 |73.5 | |21.7 |
|1 |Homo sapiens | |94.9 |46.7 |
|2 |Rattus norvegicus |94.9 | |46.5 |
|3 |Saccharomyces cerevisiae |46.7 |46.5 | |


Выводы из таблицы: Белки организмов Homo sapiens и Rattus norvegicus
можно считать идентичными. Белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae
значительно отличается от них. Участки, соответствующие месту расщепления
каспазами можно считать консервативными. Можно предположить, что участок
DXXD находится в спейсере предполагаемого двучастичного NLS. Расщепление
каспазой в этом случае приведет к изменению внутриклеточной локализации
белка, что сделает невозможным выполнение его функции.
[pic]
. Семейство белков ( альфа субъединицы фактора инициации транскрипции -
IIF, способствуют элонгации транскрипции (T2FA).
Таблица сходства:
| |Название вида |1 |2 |3 |
|1 |Drosophila melanogaster | |37.8 |37.2 |
|2 |Homo sapiens |37.8 | |73.8 |
|3 |Xenopus laevis |37.2 |73.8 | |


Белки организмов Homo sapiens и Xenopus laevis можно считать идентичными.
Белок плодовой мушки Drosophila melanogaster значительно отличается от них.
Места расщепления каспазой и предполагаемого NLS у всех этих организмов
совпадают полностью.
[pic]
* * *
Искомые участки консервативны в различающихся по своей аминокислотной
последовательности гомологах. Поэтому эти белки можно считать подходящими
для исследования их взаимодействия с каспазами.

Анализ третичной структуры

Другой подход к решению задачи - исследование третичных структур
предполагаемых субстратов каспаз. Поиск первичных структур, подходящих под
паттерн в базе Swissprot и имеющих при этом определенную экспериментально
третичную структуру был проведен с помощью программы ProSite.
Поиск дал 2 белка:
TUB_MOUSE (tubby-белок мозга мыши) - предположительно, уникальный
двучастичный транскрипционный фактор. Он был найден с помощью паттерну 1.
ESA1_YEAST (ацетилтрансфераза гистонов дрожжей). Был найден с помощью
паттерна 3.
Для этих белков не определена их внутриклеточная локализация, но ввиду их
функциональной активности можно предположить, что они находятся в ядре.
Необходимым условием функционирования NLS и места расщепления каспазами
является их нахождение на поверхности белка. Исследования трехмерной
структуры, используя программу Swiss-PdbViewer 3.7, TUB_MOUSE и ESA1_YEAST
показали, что участок, соответствующий паттерну действительно, находится на
поверхности. В одном случае у TUB_MOUSE участок DXXD входит в состав петли,
в случае ESA1_YEAST - в ?-спираль (РИС. 4,5).
Еще один подход - исследование сходства мест узнавания каспазами по
третичным структурам у известных и возможных субстратов каспаз. Если
выбранные элементы в третичной структуре совпадают, то это является веским
аргументом в пользу того, что данные субстраты взаимодействуют с каспазами.

С помощью сервиса SRS в базе данных SwissProt были найдены ID известных
каспазных субстратов по их генам, а также ссылки на их третичные структуры,
поиск которых проводился в базе PDB-структур (РИС. 1-3).
Изображение структур известных каспазных субстратов:
[pic]
Рис. 1. Bcl-2, синим цветом выделено место расщепления каспазами.
[pic]
Рис. 2. Сdc42, синим цветом выделено место расщепления каспазами.
[pic]
Рис. 3. Pp2a, синим цветом выделено место расщепления каспазами.
Изображение структур возможных каспазных субстратов:

[pic]
Рис. 4. TUB_MOUSE, синим цветом выделено место расщепления каспазами.
[pic]
Рис. 5. ESA1_YEAST, синим цветом выделено место расщепления каспазами.
Как видно из данных рисунков у известных субстратов каспаз участок DXXD
входит в состав петли. Из возможных субстратов каспаз место расщепления
входит в состав петли у TUB_MOUSE, а у ESA1_YEAST оно содержится в ?-
спирали. Это позволяет считать TUB_MOUSE наиболее вероятным каспазным
субстратом из рассмотренных. Вероятность того, что ESA1_YEAST расщепляется
каспазами значительно ниже.
Основываясь на выбранных нами критериях, предлагаем следующие белки для
дальнейшего изучения на предмет взаимодействия с каспазами 2, 3. 7:
TUB_MOUSE, белки семейств со следующими мнемоническими названиями в
Swissprot: VSX1, T2FA, T2FA, SX11, FXD3, NOP5, T2FA.


4. Экспериментальная часть

Выполнение поиска по паттерну в базе аннотированных белковых
последовательностей Swissprot:
1) Получили список ядерных белков из банка белковых последовательностей
Swissprot (данные на 11 мая 2003) c помощью сервисной системы
SRS(http://srs.ebi.ac.uk/):
В окне SRS были заданы параметры поиска: comment type -
subcellular

comment - nuclear

2) Мы использовали полученные ID известных ядерных белков. С помощью
программы FuzzPro пакета EMBOSS нашли те из них, которые удовлетворяют
паттернам, указанным выше.


5. Выводы

. Предложена модельная последовательность для поиска биоинформатическими
методами новых субстратов каспаз.
. Найдены 193 белка являющиеся потенциальными субстратами каспаз.
. Разработаны критерии для выбора наиболее перспективных белков для
дальнейших экспериментальных исследований и, исходя из этих критериев,
предложены 7 семейств белков со следующими мнемоническими названиями
в Swissprot: VSX1, T2FA, T2FA, SX11, FXD3, NOP5, T2FA и белок tubby
из организма Mus musculus как наиболее вероятные субстраты каспаз 2,
3, 7.

6. Список литературы

1. "Реконструкция метаболизма витаминных коферментов в бактериях методами
сравнительной геномики", диссертационная работа, Д.А. Родионов,
Москва(2003)
2. "Программируемая клеточная смерть"
В.Д. Самуилов, А.В. Олескин, Е.М. Лагунова (2003)
http://evolution.powernet.ru/library/death_of_sell.htm
3. "Роль апоптоза в патогенезе заболеваний", Н.Н Белушкина (2003)
http://www.it-med.ru/library/r/rol_3.htm
4. "Апоптоз в эволюционном плане"(2003)
http://obi.img.ras.ru/humbio/APON/0000bd15.htm
5. U. Fischer, R.U. Ja nicke and K. Schulze-Osthoff, Cell Death and
Differentiation, 10, 76-100 (2003).
6. "Фрагментация белков рекомбинантной каспазой 3 человека", дипломная
работа,
В.С Морозов, Москва(2000)
7. V. Cryns and J. Yuan, Genes and Development, 12, 1551-1570 (1998)
8. "Structure and Enzymatic Activity of Caspases" (2003)
www.medicine.uiowa.edu/pathology/path_folder/research/cohen/Cohen/encycloped
ia/Caspases/Structur.htm
9. "Аминокислотные последовательности, обеспечивающие транспорт белка
протимозина ( в ядро клеток дрожжей S. сerevisiae", дипломная работа,
В.Р. Шакулов, Москва(1998)
10. "NLS (Сигналы ядерной локализации, nuclear localization signal)" (2003)
http://obi.img.ras.ru/humbio/nuctrans/0001f862.htm