Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.su/FBB/year_02/science_1/Kuzmina.doc Дата изменения: Fri Nov 14 12:04:32 2003 Дата индексирования: Mon Oct 1 22:25:31 2012 Кодировка: koi8-r

Выравнивание аминокислотных последовательностей эндонуклеаз рестрикции II-
ого типа. Построение модели взаимодействия эндонуклеазы MvaI с ДНК

Кузьмина Ю.Л., Судьина А.Е., Кубарева Е.А.

Факультет Биоинженерии и Биоинформатики и НИИ Физико-Химической Биологии
им. А.Н. Белозерского, Московский Государственный Университет им. М.В.
Ломоносова


Эндонуклеазы рестрикции II-ого типа представляют собой ферменты, которые
выполняют функцию защиты бактериальной клетки от проникновения в нее
чужеродной ДНК. На сегодняшний момент известно более 3500 различных
эндонуклеаз рестрикции II-го типа. Сравнительный анализ ЭР не выявил
существенной гомологии в их аминокислотных последовательностях. Тем не
менее, следует отметить, что во всех эндонуклеазах, для которых был сделан
рентгено-структурный анализ (РСА), можно выделить один и тот же структурный
фрагмент, хотя сами эндонуклеазы относятся к различным подтипам. Изучение
новых эндонуклеаз рестрикции, а также сравнение результатов, полученных
структурными методами, с биохимическими данными и результатами
компьютерного моделирования структуры активного центра данного типа
ферментов позволит не только дать ответ на вопрос о природе специфического
ДНК-белкового узнавания, но также будет способствовать выявлению
эволюционной взаимосвязи между эндонуклеазами II-ого типа.
Объектом наших исследований являлась эндонуклеаза рестрикции MvaI,
относящаяся к подтипу ортодоксальных эндонуклеаз рестрикции. Был проведен
сравнительный анализ (выравнивание) аминокислотной последовательности MvaI
и эндонуклеаз рестрикции, для которых есть данные РСА. На основании
полученных данных было построено филогенетическое дерево, что позволяет
установить эволюционную взаимосвязь этого фермента с другими эндонуклеазами
рестрикции, и промоделирована структура каталитического центра MvaI.


ВВЕДЕНИЕ

Ферментативная система рестрикции-модификации ДНК была открыта в 1953
г. С.Луриа, Г.Бертани и Дж.Уэйглом [1,2] при изучении хозяйской
специфичности фагов. Они обнаружили, что при заражении штамма E.coli K12
фагом лямбда клетки ограничивают (рестриктируют) размножение фага и в то же
время модифицируют его таким образом, что фаговые частицы становятся
способными эффективно размножаться. Модификация выражалась в метилировании
оснований, занимающих определенное место в ДНК.
В 1962 г. В.Арбер [3] совместно с сотрудниками выявил механизм
«ограничения, вызванного клеткой-хозяином». При этом процессе ДНК
бактериофага расщепляется на фрагменты под действием эндонуклеазы
рестрикции, действующей совместно с ДНК-метилтрансферазой. При этом
бактериальная эндонуклеаза распознает определенную последовательность
нуклеотидов в бактериофагальной ДНК и в соответствующих участках расщепляет
эту ДНК, тем самым инактивируя ее. Метилтрансфераза распознает такую же
последовательность в ДНК бактериальной клетки, метилирует ее и тем самым
предохраняет от ферментативного разрушения собственной эндонуклеазой. Арбер
назвал эту систему из двух ферментов системой рестрикции-модификации.
К 1976 г. было обнаружено более 40 эндонуклеаз рестрикции, и для 23
были определены последовательности узнавания. В 1988 г. выделено 1317
эндонуклеаз из 1107 штаммов, относящихся к 117 родам и 335 видам бактерий.
В настоящее время системы рестрикции-модификации найдены практически у всех
исследованных бактерий. Гены, ответственные за эти процессы, могут быть
локализованы в геноме бактерии-хозяина, в плазмидах и в геноме фагов.
Выделение большого количества эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз
позволило изучить их свойства, систематизировать и разработать номенклатуру
и классификацию.
По особенностям субъединичной структуры, регуляции собственной
экспрессии, потребности в кофакторах, механизму и субстратной специфичности
ферменты системы рестрикции-модификации в основном делят на 4 типа [4,5]
(таблица 1).

Таблица 1. Классификация систем рестрикции-модификации.
|Класс |Тип I |Тип II |Тип III |Тип IV |
|фермента | | | | |
|Структура |Бифункциональ-н|Отдельно |Бифункциональ-н|Метил-зависимая|
|белка |ый фермент; |эндонуклеаза и |ый фермент; |эндонуклеаза |
| |состоит из трех|метилтрансфера-|состоит из двух| |
| |субъединиц |за |субъединиц | |
|Последова-т|Двусторонняя и |Короткая |Асимметричная |Последователь-н|
|ельность |асимметричная |последователь-н|последователь-н|ость не |
|узнавания |последователь-н|ость (4-6 пар |ость (5-7 пар |определена; |
| |ость |оснований), |оснований) |гидролизуют |
| | |часто | |только |
| | |палиндромная | |метилирован-ные|
| | | | |, |
| | | | |гидроксомети-ли|
| | | | |рованные и |
| | | | |гликозил-гидрок|
| | | | |сомети-лированн|
| | | | |ые субстраты |
|Последова-т|Неспецифичная, |Та же, что и |Отдалена от |Отдалена от |
|ельность |примерно на |последователь-н|последователь-н|последователь-н|
|разрезания |расстоянии 1000|ость узнавания,|ости узнавания |ости узнавания |
| |пар оснований |или близко от |участком в |участком в ~ 30|
| |от |нее |24-26 пар |пар оснований |
| |последователь-н| |оснований | |
| |ости узнавания | | | |
|Гидролиз и |Взаимно |Отдельные |Одновременные |? |
|метилиро-ва|исключающие |реакции | | |
|ние | | | | |
|Необходи-мо|Да |Нет |Да |Да |
|сть АТФ для| | | | |
|гидролиза | | | | |

Ферменты I-ого типа обладают метилирующей активностью и АТФ-зависимой
эндонуклеазной активностью в случайных участках, отстоящих от участка
узнавания примерно в 1000 пар оснований. Эта особенность исключает
возможность использования эндонуклеаз данного типа для специфического
фрагментирования ДНК. Ферменты III-его типа также обладают двумя
активностями, но внесение разрывов проводят в специфических участках,
расположенных на строго фиксированном расстоянии (24-26 п.н.). Однако
ферменты данного типа также не нашли применения в генно-инженерных
экспериментах, так как не осуществляют полного расщепления ДНК по всем
узнаваемым последовательностям, что затрудняет интерпретацию получаемых
результатов. Ферменты I и III типов узнают неметилированные
последовательности в ДНК-субстрате. Первые эндонуклеазы IV-ого типа были
открыты сравнительно недавно и на данный момент изучены плохо, поэтому пока
рано говорить об их применении в молекулярно-биологической практике.
Системы рестрикции-модификации II-ого типа включают 2 отдельных
фермента: эндонуклеазу рестрикции и ДНК-метилтрансферазу. Эндонуклеазы типа
II играют ключевую роль в разработке методов получения рекомбинантных ДНК,
картировании ДНК, хромосомном анализе, а также применяются как модельные
белки для выяснения центрального вопроса молекулярной биологии о природе
специфического ДНК-белкового узнавания. Широкое использование данного типа
эндонуклеаз в молекулярно-биологической практике обусловлено тем фактом,
что они в большинстве своем узнают палиндромные последовательности длиной 4-
8 пар оснований и полностью расщепляют ДНК по этим специфическим
последовательностям.
Кофакторами расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции являются ионы
двухвалентного металла, например, магния Mg2+, хотя некоторые из них
требуют дополнительной активации. При взаимодействии с ДНК-субстратом
эндонуклеазы рестрикции действуют в виде мономеров, димеров или даже
тетрамеров. Как правило, эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы II-
ого типа существуют независимо друг от друга. Метилтрансферазы II-ого типа
обычно ведут себя как мономеры и переносят метильные группы от донора S-
аденозил-L-метионина (AdoMet) на модифицируемое гетероциклическое основание
участка узнавания. Исходя из природы гетероциклического основания и позиции
метилирования, различают нестолько типов метилтрансфераз II-ого типа:
(цитозин-N4)-, (цитозин-C5)- и (аденозин-N6)-ДНК метилтрансферазы. Для
большинства эндонуклеаз рестрикции II-ого типа характерно блокирование
гидролитической функции при метилировании участка узнавания.
На сегодняшний день известно более 3500 различных эндонуклеаз
рестрикции II-ого типа. Открытие новых эндонуклеаз рестрикции поставило
исследователей перед необходимостью введения дополнительной классификации
внутри ферментов рестрикции II-ого типа. Тех критериев, которые были
использованы при классификации систем рестрикции-модификации, уже было
недостаточно.
Все изученные эндонуклеазы рестрикции II-ого типа могут быть
классифицированы по самой важной характеристике - субстратной
специфичности. Основными проявлениями специфичности являются:
. узнаваемая последовательность нуклеотидов;
. место расщепления;
. зависимость активности эндонуклеаз от характера метилирования
оснований в пределах узнаваемой последовательности.
По узнаваемой последовательности эндонуклеазы рестрикции делят на две
группы: ферменты, узнающие последовательности с элементами симметрии, и
ферменты, узнающие несимметричные последовательности.
В свою очередь, среди эндонуклеаз, узнающих симметричные
последовательности, можно выделить следующие подгруппы:
1) эндонуклеазы, узнающие палиндромные последовательности, то есть
последовательности, обладающие центральной симметрией и «читающиеся»
одинаково в обе стороны от оси симметрии (например, TCGA);
2) эндонуклеазы, узнающие «разорванные» последовательности, то есть в
середине палиндромов могут находиться от 1 до 6 любых нуклеотидов
(например, GANTC, где N - любой нуклеотид);
3) эндонуклеазы, узнающие вырожденные последовательности, то есть в
палиндромах присутствуют альтернативные основания, занимающие
симметричные позиции (например, GT(A/C)(G/T)AC);
4) эндонуклеазы, узнающие «разорванные» вырожденные последовательности
(например, PuGG(A/T)CCPy, где Pu и Py - пуриновые и пиримидиновые
нуклеотиды, соответственно).
Как уже было сказано ранее, эдонуклеазы рестрикции II-ого типа и
соответствующие ДНК-метилтрансферазы являются независимыми ферментами и
кодируются различными генами. Однако недавно было обнаружено, что для
некоторых систем рестрикции-модификации II-ого типа характерно объединение
генов эндонуклеазы и метилтрансферазы в один составной ген.
Исходя из всего вышесказанного была предложена внутренняя классификация
эндонуклеаз рестрикции II-ого типа (Таблица 2). Необходимо заметить, что
данная классификация не является единственно возможной и однозначной, а
скорее предлагает достаточно гибкое соотнесение ферментов со схожими
характеристиками по группам.

Таблица 2. Подтипы эндонуклеаз рестрикции II-ого типа.


|Подтип |Характерные особенности |Пример |Участок узнавания |
|IIA |Ассиметричный участок |AciI |(N N N C C G C |
| |узнавания | |N N (N G G C G |
|IIB |Расщепление происходит по|BcgI |N N (N10 C G A N6 T G C N10 N N( |
| |обе стороны от участка | |(N N N10 G C T N6 A C G N10( N N |
| |узнавания в обеих цепях | | |
| |ДНК-субстрата | | |
|IIC |Симметричный или |GsuI |C T G G A G N14 N N( |
| |асимметричный участок | |G A C T T C N14( N N |
| |узнавания. Эндонуклеазная| | |
| |и метилтрансферазные | | |
| |функции сосредоточены в | | |
| |одной полипептидной цепи | | |
|IIE |Для гидролиза необходимо |NaeI |G C G C G C |
| |два участка узнавания, | |C G C G C G |
| |один из которых действует| | |
| |как аллостерический центр| | |
|IIF |Для гидролиза необходимо |NgoMIV |G C C G G C |
| |два участка узнавания, | |C G G C C G |
| |оба участка гидролизуются| | |
| | | | |
| |Фермент действует в виде | | |
| |гомотетрамера | | |
|IIG |Симметричный или |Eco57I |C T G A A G N14 N N( |
| |асимметричный участок | |G A C T T C N14( N N |
| |узнавания. Эндонуклеазная| | |
| |и метилтрансферазные | | |
| |функции сосредоточены в | | |
| |одной полипептидной цепи.| | |
| |Активность регулируется | | |
| |присутствием AdoMet | | |
|IIH |Симметричный или |AhdI |G A C N N N( N N G T C |
| |асимметричный участок | |C T G N N N( N N C A G |
| |узнавания. Эндонуклеазная| | |
| |и метилтрансферазные | | |
| |функции сосредоточены в | | |
| |одной полипептидной цепи.| | |
| |Генная организация | | |
| |соответствует I-му типу | | |
| |эндонуклеаз | | |
|IIM |Участок узнавания |DpnI |G mA T C |
| |метилирован | |C T mA G |
|IIP |Узнает в ДНК палиндромную|EcoRI |G A A T T C |
| |последовательность | |C T T A A G |
| |Гидролиз происходит | | |
| |внутри или по соседству с|EcoRV |G A T A T C |
| |участком узнавания | |C T A T A G |
| |Фермент действует в виде | | |
| |гомодимера |BglI |G C C N N N N N G G C |
| | | |C G G N N N N N C C G |
|IIS |Ассиметричный участок | | |
| |узнавания |FokI |G G A T G N9 ( N N N N |
| |Гидролиз происходит на | |C C T A C N9 N N N N( |
| |некотором расстоянии от | | |
| |участка узнавания | | |
|IIT |Фермент состоит из двух |Bpu10I |C C T N A G C |
| |субъединиц, одна из |BslI |G G A N T C G |
| |которых обладает | | |
| |эндонуклеазной, а другая | |C C N N N N N N N G C |
| |- модифицирующей | |G G N N N N N N N C G |
| |активностью | | |

Как видно из таблицы, разнообразие ферментов рестрикции II-ого типа и
механизмов их действия довольно широко. Это и классические эндонуклеазы
рестрикции, узнающие палиндромные последовательности (тип IIP), и ферменты,
узнающие ассиметрическую последовательность нуклеотидов (типы IIA и IIS).
При этом гидролиз углеводофосфатного остова в ДНК может происходить как по
обе стороны от участка узнавания в обеих цепях ДНК-субстрата (тип IIB), так
и на некотором расстоянии от участка узнавания (тип IIS). Существует группа
ферментов, для которых необходима координация двух участков узнавания в
активном центре, при этом второй координированный субстрат может выступать
только в роли аллостерического эффектора (тип IIE), или же тоже
гидролизоваться ферментом (тип IIF). Следует также отметить тот факт, что в
некоторых ферментах II-ого типа эндонуклеазная и метилтрансферазные функции
сосредоточены в одной полипептидной цепи (типы IIG и IIH) и активность
регулируется S-аденозил-L-метионином (тип IIG), а для эндонуклеаз
рестрикции IIM вообще характерно узнавание и гидролиз метилированных
субстратов.
Cледует упомянуть также о другой особенности эндонуклеаз рестрикции II-
ого типа. Обычно разные ферменты рестрикции узнают разные
последовательности. В том случае, если обнаруженная эндонуклеаза рестрикции
узнает ранее неизвестную последовательность, ее называют прототипом. Среди
тысяч известных эндонуклеаз рестрикции с охарактеризованной субстратной
специфичностью, к 1990 году были выявлены 143 фермента-прототипа, узнающих
различающиеся нуклеотидные последовательности. Однако существуют
определенные группы ферментов рестрикции, которые выделены из разных
объектов, но узнают в ДНК одинаковые нуклеотидные последовательности. Такие
ферменты называют изошизомерами.
Сравнительный анализ ЭР не выявил существенной гомологии в их
аминокислотных последовательностях. Тем не менее, следует отметить, что во
всех эндонуклеазах, для которых был сделан рентгено-структурный анализ
(РСА), можно выделить один и тот же структурный фрагмент, хотя сами
эндонуклеазы относятся к различным подтипам. Изучение новых эндонуклеаз
рестрикции, а также сравнение результатов, полученных структурными
методами, с биохимическими данными и результатами компьютерного
моделирования структуры активного центра данного типа ферментов позволит не
только дать ответ на вопрос о природе специфического ДНК-белкового
узнавания, но также будет способствовать выявлению эволюционной взаимосвязи
между эндонуклеазами II-ого типа.

Результаты работы и их обсуждение.

Объектом нашего исследования является эндонуклеаза рестрикции MvaI,
которая узнает в ДНК пентануклеотидную последовательность и расщепляет её
по положениям, указанным стрелками:
v
5'.C - C - T - G - G .3'
3'.G - G - A - C - C .5'
^
Гидролиз сопровождается разрывом двух фосфодиэфирных связей и
образованием фрагментов ДНК, которые содержат 5'-фосфатную и 3'-
гидроксильную группы.
Эндонуклеаза рестрикции MvaI была выделена в 1985 году Янулайтисом и
соавт. из клеток Micrococcus varians RFL19 [7]. Буткусом и соавт. [8] была
обнаружена интересная особенность системы рестрикции-модификации MvaI.
Метилтрансфераза MvaI модифицирует внутренний цитозин участка узнавания по
экзоциклической аминогруппе, а не по пятому атому углерода, как большинство
других метилтрансфераз.
Эндонуклеаза рестрикции MvaI (R.MvaI) представляет собой мономерный
белок с молекулярной массой 27500 [9]. В присутствии субстрата наблюдается
увеличение молекулярной массы этого фермента до 53000, что, по-видимому,
связано с димеризацией белка при образовании фермент-субстратного
комплекса. Установлен необычный механизм функционирования эндонуклеазы
R.MvaI [10, 11]. Анализ взаимодействия R.MvaI с модифицированными аналогами
субстратов позволил сделать следующие заключения.
. Фермент преимущественно взаимодействует с группами атомов
гетероциклических оснований, расположенных по центру большой
бороздки двойной спирали ДНК. Имеющиеся данные свидетельствуют в
пользу симметричной локализации контактов эндонуклеазы MvaI в
асимметричном участке узнавания.
. Димеризуясь при связывании субстрата, две субъединицы R.MvaI
функционируют достаточно независимо. Гидролиз двух цепей ДНК может
протекать последовательно с образованием двух фермент-субстратных
комплексов для расщепления каждой из фосфодиэфирных связей.
. R.MvaI взаимодействует с обеими цепями ДНК-дуплекса.
. Каждая субъединица R.MvaI, формируя основные контакты с
гидролизуемой цепью, осуществляет ряд дополнительных
взаимодействий с противоположной цепью ДНК-дуплекса.
. Предполагается конформационная перестройка фермент-субстратного
комплекса при включении двух ионов Mg2+ в каталитический комплекс
R.MvaI с субстратом.
Задача данной работы заключается в сравнительном анализе
(выравнивании) аминокислотной последовательности MvaI и эндонуклеаз
рестрикции, для которых имеются данные РСА, а также некоторых других. На
основании полученного выравнивания требуется определить, к какому из
семейств (EcoRI- или EcoRV-подобных эндонуклеаз) может быть отнесена
MvaI, и установить эволюционную взаимосвязь этого фермента с другими
эндонуклеазами рестрикции. Построение филогенетического дерева позволит
выявить наиболее близкие к MvaI эндонуклеазы рестрикции и предложить
модель взаимодействия MvaI с ДНК-субстратом на основе данных рентгено-
структурного анализа для родственных эндонуклеаз.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей эндонуклеаз
рестрикции II-ого типа
На данный момент открыто более 3500 различных эндонуклеаз рестрикции, и
их число продолжает расти. Однако лишь для 14 из них есть данные рентгено-
структурного анализа (РСА) самого белка, и только для 10 известна структура
фермент-субстратного комплекса. Тем не менее, в большинстве из них можно
выделить один и тот же структурный фрагмент, хотя сами эндонуклеазы
относятся к различным подтипам и узнают отличные последовательности в ДНК.
Рис. 1. Вторичные структуры некоторых эндонуклеаз рестрикции.
[pic]

На рисунке 1 приведены вторичные структуры 9 белков, для которых был
сделан РСА фермент-субстратного комплекса. Структурный мотив, общий для
всех приведенных белков, выделен синим цветом и состоит из четырех (-листов
и одной (-спирали. Кружками обозначены аминокислоты, участвующие в
узнавании и связывании, а крестиками - участвующие в катализе. Как видно из
рисунка, данные ферменты можно разделить на два семейства, исходя из их
структурной гомологии. Это семейства EcoRI- и EcoRV-подобных рестиктаз.
Разделение на такие два семейства сделано не только на основе общности
структуры, но также и функций. Так, EcoRI-подобные рестриктазы связываются
с ДНК со стороны большой бороздки и гидролизуют субстрат с образованием
липких концов, в то время, как EcoRV-подобные рестриктазы атакуют ДНК со
стороны малой бороздки и гидролизуют ее с образованием тупых концов.
Таким образом, эндонуклеазы рестрикции II-ого типа имеют схожий
структурный фрагмент, что, скорее всего, говорит о том, что данный класс
ферментов имеет общего, пусть и достаточно далекого, предшественника.
Анализ первичной структуры
Сравнительный анализ (выравнивание) аминокислотной последовательности
MvaI и эндонуклеаз рестрикции, для которых есть данные РСА, показал, что
наиболее гомологичными к MvaI являются следующие ферменты. Для них даны
графики, по которым можно судить о степени гомологии и указан наиболее
подобный участок.
1) BamHI
[pic]
[pic]

Motif 1-1, Power 4.1 Homology percent 19.0 Length 42

2) EcoRI
[pic]
[pic]

Motif 1-1, Power 4.2 Homology percent 22.7 Length 22

[pic]
Motif 1-2, Power 4.2 Homology percent 14.0 Length 43
[pic]
Motif 1-3, Power 4.1 Homology percent 9.1 Length 22

3) MunI
[pic]
[pic]
Motif 1-1, Power 4.1 Homology percent 15.6 Length 32
[pic]

Motif 1-2, Power 4.0 Homology percent 22.9 Length 35

4) BglI
[pic]
[pic]

Motif 1-1, Power 4.7 Homology percent 33.3 Length 27

5) NaeI
[pic]
[pic]

Motif 1-1, Power 4.1 Homology percent 31.2 Length 16

[pic]

Motif 1-2, Power 4.1 Homology percent 13.2 Length 76


На основании результатов выравнивания были получены следующие данные по
степени гомологии эндонуклеаз.

Табл. ?3. Сравнение аминокислотных последовательностей ряда эндонуклеаз
рестрикции с MvaI.

|ЭР |Степень идентичности |Степень подобия |
|BamHI |45/263 (17,1 %) |83/263 (31,6 %) |
|BglI |45/305 (14,8 %) |98/305 (32,1 %) |
|BglII |47/271 (17,3 %) |94/271 (34,7 %) |
|BsoBI |56/323 (17,3 %) |101/323 (31,3 %) |
|Cfr10I |48/286 (16,8 %) |91/286 (31,8 %) |
|EcoRI |47/284 (16,5 %) |96/284 (33,8 %) |
|EcoRV |44/267 (16,5 %) |81/267 (30,3 %) |
|FokI |86/584 (14,7 %) |133/584 (22,8 %) |
|MunI |41/259 (15,8 %) |79/259 (30,5%) |
|NaeI |42/318 (13,2 %) |98/318 (30,8 %) |
|NgoMIV |44/288 (15,3 %) |92/288 (31,9 %) |
|PvuII |41/261 (15,7 %) |70/261 (26,8 %) |

Из таблицы видно, что степень гомологии очень низка.
В октябре этого года поиск в биокомпьютерных сервисах и базах данных
выявил четыре новых гипотетических белка, которые, в отличие от известных
эндонуклеаз, имели наибольшую степень подобия с рестриктазой MvaI. Однако
эти белки пока не изучены и аминокислотные последовательности есть только
для двух из них. На основании этого были сделаны парные выравнивания.
Для первого белка:
[pic]
[pic]

Motif 1-1, Power 6.9 Homology percent 31.7 Length 63

[pic]

Motif 1-2, Power 6.7 Homology percent 41.8 Length 55

[pic]

Motif 1-3, Power 5.2 Homology percent 47.8 Length 23

[pic]

Motif 1-4, Power 4.9 Homology percent 57.1 Length 14

Для второго:
[pic]
[pic]

Motif 1-1, Power 8.0 Homology percent 45.3 Length 53

[pic]

Motif 1-2, Power 6.5 Homology percent 23.4 Length 64

[pic]

Motif 1-3, Power 5.5 Homology percent 23.1 Length 52


К этим гипотетическим белкам можно добавить также полученный ранее
аэролизин.
[pic]
[pic]

Motif 1-1, Power 4.2 Homology percent 33.3 Length 15

[pic]

Motif 1-2, Power 4.1 Homology percent 36.8 Length 19

Для них также была сделана следующая таблица.
Табл. ?4. Сравнение аминокислотных последовательностей гипотетических
белков с MvaI.
|Название белка |Степень идентичности |Степень подобия |
|Aerolysin |52/327 (15,9 %) |103/327 (31,5 %) |
|TV1439 |50/349 (14,3%) |101/349 (28,9%) |
|TV1441 |51/341 (15,0%) |80/341 (23,5%) |


Проанализировав первичную структуру MvaI, мы можем сказать, что
исследуемая эндонуклеаза ближе всего к гипотетическим белкам, а из
эндонуклеаз рестрикции с известной структурой - к BamHI. Однако из
экспериментальных данных известно, что MvaI для катализа требует два иона
магния, как и EcoRV.
Анализ вторичной структуры

[pic]
На основании рентгеноструктурного анализа эндонуклеаз рестрикции,
Буйнитский [11] предположил схему их эволюции (рис. ?2). Согласно данным
этого же автора (персональное сообщение) R.MvaI попадает в ?-семейство
эндонуклеаз рестрикции. Однако согласно полученным нами данным о парных
выравниваниях этот фермент проявляет наибольшую гомологию с BamHI, который
локализован в ?-семействе. Таким образом вопрос о принадлежности изучаемого
объекта остается открытым.

Анализ третичной структуры
Чтобы установить эволюционную взаимосвязь этого фермента с другими
эндонуклеазами рестрикции, было сделано множественное выравнивание.
[pic]
И по нему построено филогенетическое дерево.
[pic]
Однако, стоит отметить, что построение филогенетического дерева не
вполне корректно из-за очень маленького процента гомологии.
Каталитический центр.
В результате парного выравнивания эндонуклеаз рестрикции с MvaI
оказалось, что каталитический мотив BamHI расположен в участке наибольшей
гомологии.
[pic]
Отсюда можно предположить, что каталитический мотив MvaI тоже
расположен в этом промежутке. И, скорее всего, это DFH. Наличие в нем
подтверждается экспериментальными данными. Для получения более подробной
информации о нахождении D/EXK мотива было сделано еще одно множественное
выравнивание известных эндонуклеаз рестрикции по их каталитическим центрам.
[pic]
- красным отмечено место (каталитический мотив), по которому было
сделано выравнивание
Данные по каталитическим центрам представлены в таблице.
Табл. ?5. Последовательности каталитических мотивов у эндонуклеаз
рестрикции II-го типа.
|Фермент |PD motif |D/EXK motif |
|EcoRI |PD91 |E111AK |
|EcoRV |PD74 |D90IK |
|BamHI |ID74 |E111FE |
|PvuII |ND58 |E68LK |
|Cfr10I |PD134 |(E204)S188VK |
|FokI |PD450 |D467TK |
|BglI |PD116 |D142IK |
|MunI |PD83 |E98IK |
|NaeI |TD86 |D95CK |
|BglII |ID84 |E93VQ |
|NgoMIV |PD140 |(E201)S185CK |
|BsoBI |VD212 |E204LK |

По итогам выравнивания можно сделать несколько предположений о
нахождении в MvaI PD мотива (возможные участки отмечены розовым). Вероятнее
всего им является участок VD.

Также выяснилось, что предыдущее выравнивание неверно.



Материалы и методы.

1. Поиск аминокислотных последовательностей.
Поиск аминокислотных последовательностей производится в базах данных
SwissProt и TREMBL.
Заходим на сайт http://www.genebee.msu.ru, далее по ссылкам Russian EMBnet

(Databases (TREMBL. В Search выбираем нужный для нас банк данных
(SwissProt/TREMBL), в окне for набираем название искомой эндонуклеазы.
Программа выдает список найденных белков. Из этого списка выбираем
подходящий и получаем полную информацию о нем, включяя аминокислотную
последовательность в FASTA-формате. Сохраняем полученный вариант как
текстовый документ (*.txt)
2. Попарные выравнивания эндонуклеазы рестрикции MvaI и эндонуклеаз, для
комплексов которых с ДНК сделан рентгеноструктурный анализ.
С сайта http://www.genebee.msu.ru по ссылкам заходим на Genebee. Далее
DotHelix-Construction of the Full Local Similarity Map. В окне,
предназначенном для последовательностей вводим две последовательности,
которые необходимо выровнить, и нажимаем Run query. Получаем выравнивание
наиболее гомологичного участка, рисунок, наглядно показывающий степень
подобия и матрицу. Программа ClustalW 1.75 показывает полное выравнивание
последовательностей с указанием степени гомологии прямо в выравнивании.
Также эта программа строит филогенетическое дерево.
3. Поиск *.pdb файлов трехмерных структур родственных MvaI эндонуклеаз с
ДНК.
Заходим на сайт http://www.rcsb.org/pdb/. Поиск производится по тому же
принципу (также еще нужно сделать пометку в match exact word ). Результатом
поиска будет список, из которого нужно выбрать структуры, которые находятся
в комплексе с ДНК.
4. Поиск сайта разрезания.
Производится по тому же принципу, что и остальные поиски, на сайте
http://rebase.neb.com.
5. Получение множественного выравнивания. Получение множественного
выравнивания происходит следующим образом. Заходим на сайт
http://www.genebee.msu.ru, далее по ссылкам Genebee>Multiple aligment
AliBee Release 2.0. В окне Extra tree format выбираем Phylip и вставляем
нужные выравнивания в предназначенное для этого окошко. Получаем
множественное выравнивание.
6. Получение двумерной картинки и процентная доля гомологии получается на
pvm-машине посредством команд nucplot и stretcher.
7. Обработка полученного множественного выравнивания производится в
программе Genedoc.


Список литературы.

1. Bertani, G., and Weigle, J.J.. (1953) Host-controlled variation in
bacterial viruses. J.Bacteriol., V. 65, P. 113-121.
2. Luria, S.E., and Human, M.L. (1952) A nonhereditary, host-induced
variation of bacterial viruses. J.Bacteriol., V. 64, P. 557-569.
3. Arber, W., and Dussoix, D. (1962) Host specificity of DNA produced by
Escherichia coli. Host controlled modification of bacteriophage
lambda. J. Mol. Biol., V. 5, P. 18-36.
4. Wilson, G.G., and Murray, N.E. (1991) Restriction and modification
systems. Annu. Rev. Genet., V. 25, P. 585-627.
5. Roberts, R.J., Belfort, M., Bestor, T., Bhagwat, A.S., Bickle, T.A.,
Bitinaite, J., Blumenthal, R.M., et al. (2003) A nomenclature for
restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and
their genes. Nucleic Acids Res., V. 31, P. 1805-1812.
6. Raleigh, E.A., and Wilson, G. (1986) Escherichia coli K-12 restricts
DNA containing 5-methylcytosine. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., V. 83,
P. 9070-9074.
7. Butkus, V., Klimasauskas, S., Kersulyte, D., Vaitkevicius D., Lebionka
A., Janulaitis S. (1985) Investigation of restriction-modification
enzymes from M. varians RFL19 with a new type of specificity toward
modification of substrate. Nucleic Acids Res. V. 13. N16. N. 5727-
5746.
8. Янулайтис, А.А., Вайткявичус, Д.П. (1985) Новый методический подход к
разработке технологии получения рестрикционных эндонуклеаз. Разработка
схемы выделения гомогенного препарата рестриктазы MvaI. Биотехнология,
N1, с. 39-51.
9. Овечкина К.Г., Попова С.Р., Зиновьев В.В., Вайткявичус Д.П., Янулайтис
А.А., (1988) Горбунов Ю.А., Малыгин Э.Г. Индуцируемая
олигонуклеатидным субстратом димеризация эндодизоксирибонуклеазы MvaI.
Биополимеры и клетка. Т. 4. N4. с. 239-242.
10. Gromova E.S., Kubareva E.A., Vinogradova M.N., Oretskaya T.S.,
Shabarova Z.A. Peculiarities of recognition of CCA/TGG sequences in
DNA by restriction endonucleases MvaI and EcoRII. - J. of Molecular
Recognition, 1991, v. 4, p. 133-141.
11. Sheflyan G.Y., Kubareva E.A., Gromova E.S., Shabarova Z.A.
Conformational transition of restriction endonuclease MvaI-substrate
complex under the influence of Mg2+ probed by DNA-protein cross-
linking studies. - Bioconjugate Chemistry, 1998, v. 9, N6, p. 703-707.
12. Bujnicki J.M. Understanding the evolution of restriction -
modification systems: Clues from sequence and structure comparisons.
Acta Biochimica Polinica 2001, v. 48. N4. p. 935-967