Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.su/FBB/year_02/science_1/Nevedomskaya.doc Дата изменения: Fri Nov 7 13:01:42 2003 Дата индексирования: Mon Oct 1 22:53:17 2012 Кодировка: koi8-r

Кинетическое описание dUTPase - фермента метаболизма нуклеотидов бактерии
Escherichia coli.

Неведомская Е.В.
Факультет биоинженерии и бионформатики МГУ.
Руководитель: О. Дёмин.
2003г.
В работе проводится исследование кинетических свойств фермента метаболизма
нуклеотидов бактерии E.coli dUTPase, который в геноме кодируется геном dut.
Из баз данных получены значения экспериментально измеренных кинетических
констант этого фермента. Построена кинетическая модель работы фермента с
учетом ингибирования и без него. Используя экспериментальные данные и пакет
программ DBsolve5, найдены параметры уравнения скорости работы этого
фермента и определен тип ингибирования.


Введение.

Химическая кинетика - раздел физической химии, изучающий скорости и
механизмы химических реакций. Методы химической кинетики активно
используются в биологии для описания процессов, происходящих в клетке и
организме.
В живых организмах протекает огромное количество различных химических
реакций, необходимых для его существования. Для их протекания в
лабораторных условиях понадобились бы высокие температуры и резкие
изменения других параметров (например, давления). Но в клетке они идут с
большой скоростью в нормальных условиях. Это происходит за счет ферментов -
специфических белков, присутствующих во всех живых клетках и играющих роль
биологических катализаторов. Посредством этих белков осуществляются все
процессы обмена веществ и энергии в живых организмах.
Избирательное ускорение химических реакций в живом организме под влиянием
ферментов называется ферментативным катализом. Он основан на значительном
снижении энергии активации катализируемой реакции в результате образования
промежуточных фермент- субстратных комплексов. Фермент, соединяясь с
субстратом, образует короткоживущий фермент- субстратный комплекс. По
завершении реакции этот комплекс распадается на продукт (или продукты) и
фермент. Фермент в реакции не изменяется и может вновь взаимодействовать с
новой молекулой субстрата. Таким образом образуется ферментативный цикл:

Рис1. Наиболее простой ферментативный цикл.

Субстрат+Фермент ( Фермент - ( Фермент+Продукт(ы)
субстратные
комплексы


Для перевода исходного вещества через ряд промежуточных соединений в
продукт обычно несколько ферментов действуют один за другим. Такая
последовательность реакций называется метаболическим путем.
Механизмы протекания ферментативных реакций сложны и разнообразны, зависят
от большого числа переменных величин и в ряде случаев пока не поддаются
математическому описанию.
В простейших случаях зависимость скорости химической реакции от
концентрации фермента и субстрата описывается уравнением Михаэлиса-Ментен.
С возрастанием концентрации фермента растет и скорость ферментативной
реакции. При данной концентрации фермента скорость реакции возрастает с
увеличением концентрации субстрата. Теоретическая максимальная скорость
реакции Vmax никогда не достигается, но наступает момент, когда дальнейшее
увеличение концентрации субстрата уже не влечет за собой заметного
изменения скорости реакции.

Рисунок 2.Зависимость скорости ферментативной реакции V от концентрации
субстрата S.
Vmax














S
Для простейшего каталитического цикла (см. рис.1) в стационарном состоянии
выражение для скорости ферментативной реакции имеет вид:
Уравнение Михаэлиса-Ментен (1)
где S- концентрация субстрата,
Km- константа Михаэлиса по субстрату S.
Величина Km численно равна концентрации субстрата, при которой скорость
реакции равна Ѕ Vmax .
Для более сложного ферментативного цикла:

Рис 3. Ферментативный цикл с одним субстратом и двумя продуктами.
S k1
E ES
k3 k-1
Q k-3 k2 P
k-2
EQ

(ki-константы скоростей прямых реакций, k-i-константы скоростей обратных
реакций)
выражение для скорости реакции выглядит следующим образом:

Уравнение (2)


где [pic][pic]- максимальная скорость прямой реакции:


[pic]


Km-константы Михаэлиса по субстрату S и продуктам P и Q:


Ki-константы ингибирования по терминологии Клеланда [1]:




Keq-константа равновесия:
Подробное описание вывода этого кинетического уравнения можно найти в
работе W.W.Cleland [1].
Ингибиторы-вещества, снижающие скорость химических, в том числе
ферментативных, реакций или подавляющие их. Ингибиторы ферментов
используются для изучения механизма их действия, для лечения нарушений
обмена веществ, а также в качестве пестицидов.
Ингибирование ферментативных реакций может быть обратимым и необратимым. В
обоих случаях ингибитор способен к образованию комплекса с ферментом, но не
может быть подвергнут каталитическому превращению и препятствует
образованию комплекса фермент-субстрат.
Обычно различают конкурентное и неконкурентное ингибирование.
При конкурентном ингибировании молекулы ингибитора I и субстрата S
конкурируют за присоединение к активному центру фермента Е.
При неконкурентном ингибировании ингибитор связывается с ферментом в
месте, отличном от активного центра. Это место обычно называется
регуляторным сайтом.
Необратимо реагирующие ингибиторы реагируют с ферментом, дезактивируя его;
в отличие от обратимого ингибирования активность фермента уменьшается во
времени.




Задачи.

Цель данной работы состоит в том, чтобы построить кинетическую модель
функционирования фермента dUTPase из E.coli, найти механизмы ингибирования
данного фермента и оценить параметры, отвечающие за его кинетическое
поведение.
E.coli- кишечная палочка, один из наиболее обычных представителей
нормальной кишечной флоры млекопитающих, сбраживает глюкозу, лактозу и
другие углеводы. E.coli- классический объект микробиологических и
молекулярно- генетических исследований, имеет одну из наиболее полно
составленных генных карт.
В данной работе проводится изучение фермента, катализирующего реакцию
гидролиза дезоксиуридинтрифосфата (dUTP) до дезоксиуридинмонофосфата (dUMP)
и пирофосфата (PP):
H2O + dUTP = pyrophosphate + dUMP

Рис. 4. Реакция, катализируемая ферментом метаболизма E.coli, кинетические
свойства которого исследуются в настоящей работе.
[pic]
Эта реакция входит в метаболический путь биосинтеза дезоксирибонуклеотидов.
Благодаря ей не происходит неправильного присоединения урацила к ДНК.
В данной работе мы получили кинетическое описание этого фермента.
Фермент называется dUTP pyrophosphotase (или dUTP diphosphotase, dUTPase
), в геноме он кодируется геном dut.
Кинетическое описание заключается в подборе параметров выведенного
уравнения зависимости скорости ферментативной реакции от концентраций
субстрата и продуктов таким образом, чтобы это уравнение соответствовало
данным, полученным экспериментально. Полученные параметры также необходимо
сравнить с экспериментально измеренными.
По определенным кинетическим константам можно оценить механизм
ингибирования данной реакции.

Материалы и методы.

Для получения экспериментальной кривой использовалась следующая статья,
найденная в базе данных PubMed [9]:
Gunilla Larsson,Per Olof Nyman, and Jan-Olov Kvassman. Kinetic
characterization of dUTPase from Escherichia coli [2].
Поиск данных по экспериментально измеренным константам Михаэлиса
проводился в базах данных BRENDA [7] и PUMA/EMP [8].
Подбор кинетических параметров проводился с помощью пакета программ
DBsolve5.


Результаты.

1. Оценка значений кинетических параметров dUTPase , используя базы данных.
В базе данных BENDA имеется следующая информация по экспериментально
измеренным константам Михаэлиса:

Таблица 1. Экспериментальные значения кажущихся констант Михаэлиса,
доступные в базе BRENDA.
| |Константа Михаэлиса,мМ |Субстрат |Источник |
| |0,00018 |dUTP |J. Biol. Chem. 271 |
| | | |23506-23511 1996 |
| |0,0015 |dUTP |Biochemistry 48 247-257 |
| | | |1962 |
| |0,004 |dUTP |Biochemistry 48 247-257 |
| | | |1962 |
| |0,008 |dUTP |Biochemistry 48 247-257 |
| | | |1962 |
| |0,012 |dUTP |J. Biol. Chem. 253 |
| | | |3305-3312 1978 |
| |0,016 |dUTP |J. Biol. Chem. 271 |
| | | |23506-23511 1996 |
|Среднее |0,00695 | | |


В других базах данных по биокинетике (PUMA/EMP) не было найдено
необходимой информации.
Среднее значение кажущейся константы Михаэлиса по dUTP составляет 6,96мкМ.
К настоящему времени констант по другим веществам в базах данных нет.
2. Оценка значений кинетических параметров dUTPase, используя
экспериментальные данные.
Для определения величин констант, входящих в уравнение (2) использовался
метод кинетического моделирования. Он заключается в построении кинетической
модели, включающей количественное описание фермента dUTPase и определение
кинетических параметров по экспериментальным данным. Последние были взяты
из работы [2]. В ней была измерена зависимость оптической плотности dUTP от
времени после добавления в реакционную смесь фермента dUTPase (см. рис. 5).
Для того, чтобы описать эксперимент, проделанный в этой работе, была
разработана следующая кинетическая модель (3):

[pic][pic]
Где [pic](мкМ) -начальная концентрация dUTP (величина начальной
концентрации взята из эксперимента в работе [2]).
Система дифференциальных уравнений (3) была численно решена, используя
пакет программ DBsolve5. Результатом ее численного решения является
зависимость оптической плотности dUTP, соответствующая экспериментально
измеренной при длине волны света равной 573нм
[pic]
от времени (eps- коэффициент экстинкции). Форма и скорость убывания А573 от
времени определяется кинетическими параметрами, входящими в уравнение (2).

Рис.5. График зависимости оптической плотности dUTP при длине волны 573
нм (А573) от времени (Time, в секундах). Квадратами показаны точки,
полученные при оцифровке экспериментальных данных из работы [2]. Черной
линией - кривая, полученная при кинетическом моделировании.



[pic]
Искомые кинетические параметры были выбраны таким образом, чтобы
экспериментальная зависимость из статьи [2] совпадала с зависимостью,
полученной при кинетическом моделировании (см. рис. 5). Величины этих
параметров, полученные при использовании пакета программ DBsolve5,
приведены ниже (в мкМ и мкМ/с): Vm=7.154773e-01 -Vmax
Keq=6.428086e+00-константа равновесия реакции
Kt=9.148040e-06 -константа Михаэлиса по dUTP
Kp=3.400584e+00 -константа Михаэлиса по пирофосфату
Kim=3.268207e+00 -константа ингибирования по dUMP
Km=7.568860e-04 -константа Михаэлиса по dUMP
Kip=1.948757e+00 - константа ингибирования по пирофосфату
eps= 2.21e-02 -коэффициент экстинкции.
Таким образом, используя метод кинетического моделирования и
экспериментальные данные, мы определили все недостающие кинетические
параметры, которые невозможно найти в базах данных, что позволило нам
полностью кинетически описать фермент dUTP pyrophosphotase из E.coli. Более
того, мы смогли определить константу Михаэлиса для дезоксиуридинтрифосфата
(dUTP), которая была доступна в базах данных. Полученное значение меньше
среднего значения кажущейся константы из баз данных примерно в 760 раз. Это
может быть объяснено недостатком разработанной кинетической модели, так как
в ней не было учтено наличие магния и ингибирования реакции свободным
субстратом. С этим, возможно, связано и плохое качество фиттинга.
3. Описание влияния магния и определение механизма ингибирования dUTPase со
стороны dUDP и dUTP.
Среди экспериментальных данных в работе [2] имеется кривая, описывающая
работу фермента в присутствии ингибитора (см. рис. 7). Кроме того, в
реакцию вступает магниевая форма dUTP, что так же необходимо учитывать при
кинетическом моделировании. Ингибиторами изучаемой реакции являются не
связанная с магнием форма dUTP, свободный dUDP (дезоксиуридиндифосфат) и
его комплекс с магнием. Поскольку тип ингибирования не известен, для
кинетического описания работы фермента в присутствии ингибитора
использовалась следующая схема:
Рис.6 Ферментативный цикл в присутствии ингибитора.
I S
I

EI E ES
ESI



Q
P

EQ


EQI

Скорости реакций E+S(ES, ES(P+EQ, EQ(E+Q равны соответственно V1, V2, V3.
В стационарном состоянии эти скорости равны, а скорости присоединения
ингибитора равны нулю. Таким образом имеем систему уравнений:
[pic][pic]
из которой с учетом наличия трех ингибиторов можно получить уравнение
скорости, выраженное через константы скоростей реакций. Далее из выражений
для констант Михаелиса и ингибирования можно вывести зависимость констант
скоростей реакций от них:
[pic]
[pic]
[pic]

[pic]

Подставив полученные выражения в выведенное уравнение скорости, получим
следующее выражение (4):
[pic]где
[pic]
[pic]
[pic][pic]
[pic]
[pic]

[pic]












[pic]-концентрации ингибиторов, [pic]- отношение констант скоростей прямой
и обратной реакций i-го ингибитора в j-той реакции ингибирования)
Необходимо учесть наличие магниевых форм вступающих в реакцию веществ и ее
ингибиторов.
Пусть [pic] может образовывать комплекс с веществом R:
[pic] [pic]
Найдем равновесное распределение свободной формы R и его комплекса с
магнием [pic], исходя из того, что полная концентрация R , концентрация Mg
и константа диссоциации комплекса известны, т.е. решим следующую систему
уравнений:
[pic]
В итоге получаем следующую зависимость концентрации свободной формы
вещества R:
[pic]
где Kd-константа равновесия реакции присоединения магния, Rtot - полная
концентрация вещества R, Mgtot - полная концентрация магния (считаем, что
концентрация магния во много раз превосходит концентрацию вещества R,
поэтому его концентрация существенно не меняется в ходе реакции),
концентрация комплекса R с магнием:
[pic]

Полученные выражения подставляются в уравнение скорости (4).

Таким образом мы получили уравнение, которое описывает зависимость
скорость работы изучаемого фермента от концентраций реальных субстратов и
продуктов с учетом ингибирования.
Для кинетического моделирования была использована следующая кинетическая
модель(5):
[pic]
где const1=const2=2 мкМ - начальная концентрация dUTP. Начальная
концентрация Mg равна 5 мМ, dUDP - 20 мкМ. [2] Скорость реакции V
определяется уравнением (4).
Численным решением системы дифференциальных уравнений (5), полученным с
помощью программы DBsolve5, является зависимость оптической плотности dUTP
(A573), соответствующая экспериментально измеренной при длине волны света
573 нм.
Рис.7 График зависимости оптической плотности dUTP (А573), измеренная при
длине волны света 573 нм, от времени (Time, в секундах). Квадратами
показаны экспериментальные значения, полученные при оцифровке данных из
работы [2], линией - кривая, полученная при кинетическом моделировании.
Нижняя кривая соответствует работе фермента без ингибитора (dUDP), верхняя
- в его присутствии.
[pic]

Кинетические параметры, входящие в уравнение (4) были подобраны с помощью
пакета программ DBsolve5 таким образом, чтобы теоретическая кривая наиболее
соответствовала экспериментальной.
Их значения (в мкМ и мкМ/с) приведены ниже:
Таблица 2. Значения кинетических констант, входящих в уравнение скорости
работы фермента dUTPase от времени с учетом ингибирования.

|Смысл константы |Обозн|Значения |
| |ачени| |
| |е | |
|Константа равновесия реакции присоединения |Kd1 |1.664881E+00 |
|магния к dUTP | | |
|Константа равновесия реакции присоединения |Kd2 |1.713939E+00 |
|магния к dUMP | | |
|Константа равновесия реакции присоединения |Kd3 |2.179233E-01 |
|магния к PP | | |
|Константа равновесия реакции присоединения |Kd4 |1.054914E+00 |
|магния к dUDP | | |
|Vmax |Vm |5.190586E-01 |
|Константа равновесия реакции |Keq |2.948670E+00 |
|Константа Михаелиса по dUTP |Kt |4.116748E-01 |
|Константа Михаелиса по пирофосфату |Kp |1.668732E+00 |
|Константа ингибирования по dUMP |Kim |1.007828E+01 |
|Константа Михаелиса по dUMP |Km |1.128359E+01 |
|Константа ингибирования по пирофосфату |Kip |9.818555E-01 |
|Коэффициент экстинкции |eps |4.644663E-02 |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki11 |1.706959E+01 |
|обратной реакций присоединения свободного | | |
|dUDP к свободному ферменту | | |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki12 |1.220316E+01 |
|обратной реакций присоединения свободного | | |
|dUDP к комплексу фермента с субстратом | | |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki13 |2.331656E+01 |
|обратной реакций присоединения свободного | | |
|dUDP к комплексу фермента и второго продукта| | |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki21 |2.564342E+01 |
|обратной реакций присоединения магниевой | | |
|формы dUDP к свободному ферменту | | |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki22 |1.720101E+01 |
|обратной реакций присоединения магниевой | | |
|формы dUDP к комплексу фермента и субстрата | | |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki23 |1.477622E+01 |
|обратной реакций присоединения магниевой | | |
|формы dUDP к комплексу фермента и второго | | |
|продукта | | |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki31 |1.357191E+00 |
|обратной реакций присоединения свободного | | |
|dUTP к свободному ферменту | | |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki32 |2.225832E+00 |
|обратной реакций присоединения свободного | | |
|dUTP к комплексу фермента с субстратом | | |
|Отношение констант скоростей прямой и |Ki33 |8.630948E+01 |
|обратной реакций присоединения свободного | | |
|dUTP к комплексу фермента и второго продукта| | |

Таким образом нам удалось полностью кинетически описать работу фермента
dUTPase из E.coli.
Из полученных данных о кинетических константах работы изучаемого фермента
можно сделать вывод, что наиболее сильным ингибитором является свободный
dUTP, присоединяясь к свободному ферменту и фермент-субстратному комплексу,
тогда как к комплексу фермента и второго продукта практически не
присоединяется. Ингибирование как свободным dUDP, так и его магниевой
формой практически одинаково по всем путям (соответствующие константы имеют
один порядок).
Поученное значение константы Михаелиса по dUTP превышает среднее значение
из баз данных примерно в 60 раз, что возможно связано с тем, что в базах
данных доступны значения для кажущейся константы Михаелиса, кроме того, без
учета ингибирования свободным субстратом. В данной работе посчитано
значение для истинной константы Михаелиса.


Литература.

[1] The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates
or products.
W.W.Cleland. 67(1963)104-137
Biochimica et biophisia acta

[2] The Journal of Biological Chemistry. Vol.271, Issue of September 27,
pp.42010-24016, 1996. Gunilla Larsson,Per Olof Nyman, and Jan-Olov
Kvassman.
[3] Современная биокинетика в схемах. Я.Мусил, О.Новакова, К.Кунц.
[4] Biochemical pathways: An antlas of biochemistry and molecular biology.
Gerhard Michal.
[5] Биокинетика. Практический курс. С.Д.Варфаломеев, К.Г.Гуревич.
[6] Fundamentals of enzyme kinetics. Athel Cormish-Bowden.
[7] http://www.brenda.bc.uni-coeln.de
[8] http://wit.mcs.anl.gov
[9] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/






-----------------------






[pic]

[pic]

[pic]

0,495

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

0,5

0,505

0,51

0,515

0,52

0,525

0,53

0,535

A573

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Time, s

Время,сек

10

9

8

7

6


5

4

3

2

1

0

A573

1.47

1.46

1.45

1.44

1.43

[pic]

1.42

1.41

1.4

1.39

1.38

dUDP=20mkM

dUDP=0