Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.fbb.msu.ru/FBB/year_02/science_1/themes_2004f/Chilov.doc Дата изменения: Thu Dec 9 21:05:40 2004 Дата индексирования: Fri Dec 21 21:47:22 2007 Кодировка: koi8-r

In silico дизайн линкерной последовательности для пермутации фермента
пенициллинацилазы

руководители: к.х.н. Гермес Чилов, профессор Витас Швядас
лаборатория биокатализа и биотрансформаций, НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского
корпус Б, к. 622, т.939-44-84, ghermes@belozersky.msu.ru

Суть задачи:

|Пенициллинацилаза - фермент, используемый |[pic] |
|в производстве полусинтетических | |
|бета-лактамных антибиотиков (ампициллин, | |
|амоксициллин, цефалексин) и в | |
|препаративном синтезе широкого спектра | |
|хиральных аминосоединений - природных и | |
|неприродных аминокислот, аминоспиртов, | |
|аминов. | |

| |Фермент состоит из двух субъединиц, |
| |образующихся из единой полипептидной |
| |цепи в результате серии |
| |пост-трансляционных модификаций: |
| |отщепления сигнального пептида с |
| |N-конца (связанного с транспортом |
| |фермента в периплазму), и |
| |автокаталитическим выщеплением |
| |эндопептида, приводящим к образованию |
| |двух субъединиц. Примечательно, что |
| |остаток серина, высвобождающийся в |
| |результате сплайсинга на N-конце |
| |В-субъединицы, отвечает за |
| |каталитическую функцию фермента. |

|Недавно было подмечено (Protein |[pic] |
|Science, 2004, 1677-1683), что | |
|N-конец А-цепи и С-конец B-цепи | |
|находятся в непосредственной | |
|близости друг от друга в трехмерной| |
|структуре фермента. Это | |
|обстоятельство было использовано | |
|для замыкания двух цепей фермента в| |
|одну, за счет зацепления С-конца | |
|B-цепи за N-конец А-цепи. | |
|'Одноцепочность' фермента делает | |
|его крайне привлекательной как в | |
|плане физикохимических свойств | |
|(повышенная стабильность), так и в | |
|плане возможности экспрессии в | |
|произвольных источниках, где | |
|аппарат пост-трансляционной | |
|модификации может не работать | |
|нужным образом. | |

|На практике две цепи сочленялись |'Счастливые' |
|(посредством методов генетической инженерии)|последовательности |
|линкерной последовательностью из четырех | |
|аминокислот. Оказалось, что далеко не любая |NEGM |
|линкерная последовательность приводит к | |
|экспрессии функционального фермента. Для |DPAG |
|поиска подходящих сочетаний была | |
|просканирована библиотека всевозможных |RGAG |
|последовательностей из 4-х аминокислот, | |
|среди которых было обнаружено несколько |GARD |
|'счастливых'. | |

В связи с этим возникает естественный вопрос - почему именно эти линкеры
приводили к экспрессии функционального фермента, каковы молекулярные
предпосылки наблюдаемого феномена? И каким образом можно использовать
накопленный опыт в конструировании одноцепочечных ферментов из других
привлекательных источников (например, из исследуемых в нашей лаборатории
родственных ферментов из Bacillus megaterium и Alcaligenes faecalis)?

Для исследования поставленной задачи предполагается использование методов
биоинформатики и молекулярного моделирования. Результаты теоретической
работы будут использованы при практическом конструировании пермутированных
ферментов, исследовании их свойств, и в потенциальных биотехнологических
приложениях.

-----------------------
сплайсинг

удаление сигнального пептида

В-субъединица

846

290

235

27

ep

A-субъединица

sp


N-конец A-цепи



С-конец В-цепи