Фюъѓьхэђ тчџђ шч ъ§јр яюшёъютющ ьрјшэћ. Рф№хё ю№шушэрыќэюую фюъѓьхэђр : http://www.genebee.msu.ru/LPSR/Dmitriev_MolBiol2006.pdf
Фрђр шчьхэхэшџ: Sun Nov 30 18:25:10 2008
Фрђр шэфхъёш№ютрэшџ: Tue Oct 2 01:31:47 2012
Ъюфш№ютър: ISO8859-5

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№?, 2006, ъуп 40, < 1, т. 25-30

јњ№љњ№§ц§ї?ц ћљље?цї№?
ќсє 577.217.52

дсцєзд§їд? ћ№ћ§цѕд сѓ? №ёќ?цї№? №ї№х№дх№№ §њдїћѓ?х№№ пњїє њц§њљ§њдїћјљёљїд L1 ?цѓљзцєд IN VITRO
? 2006 ,,. ћ. ц. сплълв,*, ї. з. еРну,, с. ц. дмвв,, №. ѕ. §ввмлм
їы~му-лттову,ъвоШтнли лмтълъыъ щлблну-iлпл~втнуи Члуоу,,лл лп. д.ї. евоубвтну,,у ѕутну,тну,,у ,,утытъ,вмму,,у ымл,втлъвъ лп. ѕ.з. ѓупумуту,, ѕутн,, 119899
јутъыфло , вн^л 09.09.2005 ,,. јвтъ,овм н фыЧолн^лл №.ї. ?ътнлп

њвъуъмтфубум L1 нулывъ ымлноШмы Чл^лтъуммы пњїє, нуъуfl fl,оflвътfl уму,впвмму ъмтфубл^луммРп лмъвпвлъуп л пъл^ви оfl тлмъвб ,ыi Чвону, ъу,,у пуЧлоШму,,у овпвмъ. ју фв,лъвоШмРп ммРп, лмл^л^лfl ъмтоfl^лл уЧулi ^лтъуму, L1 фултiулъ фу мвнмумл~втнупы пвiмлбпы. јл ъмтоfl^лл пњїє L1 , олбъв вълныоу^лъу, нуолн (ѓњє) - тъмъмуи тлтъвпв, ~тъу лтфуоШбывпуи оfl лбы~вмлfl пвiмлбпу, Члутлмъвб Чвон ы ынлуъ - мflы т уклвпРпл фуынъпл мпл уЧмыквму ЧуоШ?ув нуол~втъ,у фуынъу, Чвмъмуи лмл^л^лл м ,мыъвммлi AUG-нуумi. јууЧмРв фуынъР уътыътъ,ыъ фл ъмтоfl^лл пњїє L1 in vivo. суЧ,овмлв , тлтъвпы ^лъуфобпъл~втну,,у нтънъ новъун HeLa фл,воу н лт~вбму,вмл ЧвмъмРi фуынъу, фл туiмвмлл щщвнъл,муи ъмтоfl^лл фв,у,,у ^лтъум. ќу,вмШ ъмтоfl^лл ,ъуу,,у ^лтъум пњїє L1 тъо тывтъ,вмму млкв, ~ъу ънкв уъквъ тлъы^л in vivo. ?ъл л ы,,лв уфРъР фуб,уолол м,,оflму фунбъШ, ~ъу му,fl нупЧлмлу,ммfl тлтъвп ѓњє + HeLa ,,убу ЧуоШ?в фуiулъ оfl лбы~вмлfl пвiмлбпу, лмл^л^лл ъмтоfl^лл, ~вп уЧР~мРи ѓњє. єо~в,Рв тоу,: олбъ вълныоу^лъу, нуолн, лмл^л^лfl ъмтоfl^лл, въуъмтфубум L1, Чвмъмfl лмл^л^лfl. ADEQUATE SYSTEM FOR INVESTIGATION OF THE HUMAN RETROTRANSPOSON L1 mRNA TRANSLATION INITIATION IN VITRO, by S. E. Dmitriev*, N. V. Bykova, D. E. Andreev, I. M. Terenin (A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Moscow State University, Moscow 119992; *e-mail: dmitriev_sergey@genebee.msu.su). Retrotransposon L1 codes for a unique dicistronic mRNA which serves both a transposition intermediate and a template for the synthesis of two proteins of this mobile element. According to preliminary data, the translation initiation of both cistrons of L1 occurs by non-canonical mechanisms. When translating the L1 mRNA in rabbit reticulocyte lysate (RRL), a standard system routinely used by many researchers to study mechanisms of translation initiation in eukaryotes, we observed along with expected products a number of polypeptides resulted from aberrant initiation at internal AUG codons. Such products are absent on translation of L1 mRNA in vivo. Addition to the system of a cytoplasmic extract from HeLa cells resulted in disappearance of these abberant products whereas the efficiency of translation of the first cistron remained unchanged. The level of translation of the second cistron became significantly lower. This also made the picture closer to that observed in vivo. These and other experiments allowed us to clearly demonstrate that the new combined cell-free system is much more adequate to study mechanisms of translation initiation than a regular RRL. Key words: rabbit reticulocyte lysate, translation initiation, retrotransposon L1, aberrant initiation.

њвъуъмтфубум L1 - ~вб,Р~иму ?луну фвтъ,овммРи , ,,вмупi повнуфлълi пуЧлоШмРи овпвмъ, уъмутflлитfl н ,,ыффв LINE [1]. з фу^вттв ,уо^лл ~лтоу в,,у нуфли фв,Ртлоу 500 000, , ту,уныфмутъл умл тутъ,оflъ унуоу 17% ,тви iупутупмуи сїє ~воу,вн. пњїє, нуъуы нулывъ въуъмтфубум L1, уму,вјлмflъРв тунвмлfl: ѓњє - олбъ вълныоу^лъу, нуолн, 5'-ї§љ - 5'-мвъмтолывпfl уЧотъШ; IRES - Internal Ribosome Entry Site - ы~тъун ,мыъвммви футнл лЧутупР. *?о. фу~ъ: dmitriev_sergey@genebee.msu.su

пвмму тоыклъ ъмтфубл^луммРп лмъвпвлъуп л пъл^ви оfl тлмъвб ,ыi Чвону, въуъмтфубум: њїє-т,flбР,в,,у Чвон т мвлб,втъмуи щымн^лви (40) л уЧъмуи ъмтнлфъбР. љънРъРв пнл т~лъР,млfl ълi ,ыi Чвону, мв фввнР,ътfl л бвовмР ы~тънуп олмуи 63 м. - ънлп уЧбуп, пњїє L1 fl,оflвътfl флумуи Чл^лтъуммуи пъл^ви, ту,в?вмму мв iнъвмуи оfl ынлуъ. сы,,уи уъол~лъвоШмуи ~въуи пњїє L1 fl,оflвътfl ыл,лъвоШму олммfl (910 м.) 5'-мвъмтолывпfl уЧотъШ, фв?втъ,ыfl фв,упы ^лтъумы. љм тувклъ ,в нууънлв
25

26

сплълв, л .

пнл т~лъР,млfl л, б лтно~вмлвп футовмлi 100 м., лпввъ GC-Чу,,ъРи тутъ,. їнумв^, ъвъШви ымлноШмуи утуЧвммутъШ L1 fl,оflвътfl мупоШму ,Ртунув тувкмлв ,у ,тви утъоШмуи ~тъл пњїє вмлоу,Рi утъъну,: м мвнуъуРi ы~тънi вмлм - в, ол мв нкув ,ъуув утму,млв. зтв ъл ~въР воъ пњїє въуъмтфубум L1 лмъввтмуи пувоШ оfl лбы~вмлfl мвнмумл~втнлi пвiмлбпу, ъмтоfl^лл ы ынлуъ. ѕуовныоflмРв пвiмлбпР лмл^л^лл ъмтоfl^лл ы повнуфлълi ыуЧмвв лбы~ъШ , тлтъвпi in vitro. єоттл~втнуи ънуи тлтъвпуи fl,оflвътfl олбъ вълныоу^лъу, нуолн (ѓњє), нуъуРи л ЧРо лбЧм мпл , н~втъ,в уъф,муи ъу~нл , м?вп лттову,млл. ѓњє фвтъ,оflвъ туЧуи ^лъуфобпъл~втнли нтънъ новъун - фв?втъ,вммлну, лъу^лъу, ну,л, нуъуРи ,,уъу,лътfl фу тъмъмуи фу^выв [2] л утъыфвм , ,лв нуппв~втнлi фвфъу,, футъ,оflвпРi щлпуи "Promega". ївтпуъfl м ъу, ~ъу вълныоу^лъР - тфв^лолблу,ммРв новънл, , нуъуРi лвъ пттлу,ммРи тлмъвб Чвон т у~вмШ мвЧуоШ?у,,у мЧу пъл^ (, утму,муп ъу - л -,,оуЧлмР), ѓњє ?луну лтфуоШбывътfl оfl лбы~вмлfl ъмтоfl^лл тпРi бмРi пњїє. јл ъуп лттову,ъвол уЧР~му мв быпР,ътfl у ,убпукмРi ъвщнъi, т,flбммРi т лтфуоШбу,млвп ъуи тфв^лолблу,ммуи тлтъвпР. єн Чывъ фунбму млкв, ънув фвмвЧвквмлв утуЧвммутъflпл ѓњє мв ,тв,, уф,му. хвоШ ммуи ЧуъР - бЧуън тлтъвпР оfl лбы~вмлfl лмл^л^лл ъмтоfl^лл пњїє L1 л ы,,лi тоукму ытъувммРi пъл^ in vitro, нуъуfl ЧРо ЧР пнтлпоШму флЧолквм н ытоу,лflп, тывтъ,ылп , кл,уъмуи новънв, л фуб,уоflо ЧР фуоы~ъШ вбыоШъъР, тiумРв т фуоы~впРпл in vivo. ?єћјцњ№ѕцї§дѓ?їд? ?дћ§? ѕуовныоflму-,,вмвъл~втнлв нумтъын^лл фуоы~ол м утму,в ,внъу pGL3-Control ("Promega"). њЧуъР т фобплпл л ,,вмму-лмквмвмРв пмлфыоfl^лл фу,улол ту,,отму [3], лтфуоШбу,ол щвпвмъР щлпР "Fermentas" (ѓлъ,). ў,,пвмъ L1 т 1 фу 1993 м., ,но~ли 5'-ї§љ, фв,Ри ^лтъум л пвк^лтъуммРи ы~тъун, ЧРо фуоы~вм лб оЧвбму фвутъ,овммуи й. ћ,в,,уоуп фобплР p3LZ [4] т фупуШ јхњ т фипвпл 5'-GGCGGAGGAGCCAAGATGG-3' л 5'-CGTGGCCAGTGTCATTATGATGTTAGCTGG-3'. соfl фуоы~вмлfl нумтъын^лл pLL2 фуынъ јхњ ол,,лу,ол , ,внъу pGL3 фу тиъп SmaI-NcoI (футовмли ЧРо бъыфовм). єумтъын^л pLL2imp фуоы~ол лб pLL2 фыъвп бпвмР щ,,пвмъ HindIII-BalI м јхњ-фуынъ, фуоы~вммРи т мвв кв т фипвпл 5'-CCAGCCAAACTAAGCTTCATAAGTG-3' л 5'-CCAGATCCATGGCGGCTATGATGTTAGCTG-

GTGATTTTGC-3', уЧЧуъммРи HindIII. ј,лоШмутъШ нумтъын^ли фуъ,вкол твн,вмлу,млвп ("йвмуп", ѕутн,). њїє фуоы~ол т фупуШ њїє-фуолпвбР щ,, §7 ("Fermentas") ту,,отму фуъунуоы щлпРлб,,уъу,лъвоfl. њвн^л фу,улол , ъв~вмлв 2 ~ фл 37Рћ, т уЧflбъвоШмРп уЧ,овмлвп лм,,лЧлъу лЧумыновб RiboLock ("Fermentas"). з н~втъ,в сїєпъл^Р лтфуоШбу,ол јхњ-фуынъ, фуоы~вммРи т лтфуоШбу,млвп тууъ,вътъ,ыви фобплР л фипву, T7UTR - 5'-CGCCGTAATACGACTCACTATAGGCGGAGGAGCCAAGATGG-3' л FLA50 - 5'- (T)50AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG-3', у~лвммРи овнъущувбуп , ,,убмуп ,,вов т футовыви о^лви т фупуШ нуппв~втну,,у мЧу H-1602 щлпР "џволнум" (њуттлfl). јутов ъмтнлф^лл њїє у~лол утквмлвп LiCl. соfl ъу,,у н вн^луммуи тпвтл уЧ,оflол ,мРи уЧвп 4 ѕ LiCl, лмныЧлу,ол 1 ~ ,у оШы л ^вмълщы,,лу,ол 10 плм фл 12 000 g фл +4Рћ, утун њїє фупР,ол тъ,ууп, тувклп 70% тфлъ, 5 пѕ MgCl2 л 50 пѕ NaCH3COO, л футов футы?л,млfl тъ,уflол , ,ув. соfl ъмтоfl^лл пњїє лтфуоШбу,ол уЧЧуъммРи мыновбуи ѓњє щлпР "Promega". њвн^луммfl тпвтШ (7 пно) тувко 5 пно олбъ, уфуомвмму,,у тпвтШ плмунлтоуъ л [35S]пвълумлмуп ("Amersham") ту,,отму внупвм^лл лб,,уъу,лъвоfl, 0.5 пно ,уму,,у тъ,у пњїє л олЧу 1.5 пно ,уР, олЧу 1.5 пно уЧЧуъмму,,у плнунунну,уи мыновбуи нтънъ новъун HeLa. ?овнъущувб Чвону,Рi фуынъу, фу,улол фу ѓппол , 12%-муп фуолнлоплмуп ,,вов [3]. њлу,ъу,,щР фуоы~ол т фупуШ щутщулплкв ("Molecular Dynamics") л уЧЧъР,ол, лтфуоШбыfl фу,,ппы Image Quant 5.0. њцёќѓ?§д§? № љећќьсцї№ц з н~втъ,в пувоШмуи пъл^Р оfl фуЧу ытоу,ли ъмтоfl^лл in vitro пР лтфуоШбу,ол лтныттъ,вммы пњїє LL2 (лт. 1), моу,,л~мы фуомубпвмуи пњїє L1, му т бпвмуи ,ъуу,,у ^лтъум м ,,вм-вфуъв, нулыли о^лщвбы т,въоfl~н (Fluc). ?ъы бпвмы фл?оутШ фулб,втъл фу фл~лмв тол?нуп ЧуоШ?уи олмР ,ъууи пнл т~лъР,млfl , флумуи пњїє L1, нуъуfl твоо ЧР вв ъмтоfl^л , ѓњє нимв мвщщвнъл,муи. јл ъуп мыновуълмРи нумъвнтъ тъъу,у,,у нуум ,ъууи пнл ЧРо туiмвм. пњїє фуоы~ол §7-ъмтнлф^лви in vitro. јутнуоШны пњїє L1 , новънв фуолвмлолу,м [1], м 3'-нумв^ пњїє ЧРол ,,ввмР 50 утъъну, вмлоу,уи нлтоуъР. соfl ъу,,у , н~втъ,в сїє-пъл^Р фл тлмъвбв њїє лтфуоШбу,ол мв мвфутвтъ,вмму фобплмы сїє, јхњ-фуынъ, фуоы~вммРи т фобплР pLL2 т фипвпл T7UTR л FLA50, фв,Ри лб нуъуРi тууъ,вътъ,уѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 40 < 1 2006

дсцєзд§їд? ћ№ћ§цѕд сѓ? №ёќ?цї№? №ї№х№дх№№ §њдїћѓ?х№№ пњїє

27

,о м~оы 5'-ї§љ L1 л тувко §7-фупуъу, ,ъууи ЧРо нупфовпвмъвм уЧотъл фобплР, овкви м ттъуflмлл 200 м. футов Fluc л тувко 50 ълпллоу,Рi утъъну,. сммРи ,лмъ ,,ввмлfl ,,упумыновуълмРi ънъу, фуб,уоflвъ лбЧвкъШ ноумлу,млfl фобплР, тувкви ъны футову,ъвоШмутъШ (фууЧмРв уЧотъл т ,Ртунуи ,вуflъмутъШ внупЧлмлыъ , ЧнъвлоШмуи новънв, , вбыоШъъв ~в,,у фуоы~вътfl ,,въву,,вммfl фуфыоfl^лfl пуовныо фобплР). §мтоfl^л пњїє LL2 , ѓњє фу,улол т уЧ,овмлвп , вн^луммы тпвтШ [35S]пвълумлм, футов ~в,,у фуынъР бвоflол т фупуШ овнъущувб , јддй ,,вов фу пвъуы ѓппол. з н~втъ,в нумъуоfl лтфуоШбу,ол тъмъмы пуму^лтъуммы фуолвмлолу,ммы пњїє FL лб мЧу оfl ъмтоfl^лл щлпР "Promega" - ъ пњїє ънкв нулывъ о^лщвбы, му лпввъ футъы нууъны 5'-ї§љ (лт. 1). ї лт. 1Ч фвтъ,овм лу,ъу,,щ ,,воfl т вбыоШъъуп ъмтоfl^лл пњїє LL2 , ъвi бол~мРi нум^вмъ^лfli (уукнл 1-3). з ълi ытоу,лfli , вн^луммуи тпвтл уЧмыквмР фуынъР ъмтоfl^лл нн фв,у,,у (~ 40 нс), ън л ,ъуу,,у (~ 60 нс) ^лтъуму, - 40 л Fluc тууъ,вътъ,вмму. љмну, фуплпу ълi ,ыi фуолфвфълу,, м лу,ъу,,щв пукму мЧоъШ вв мвтнуоШну фуоут т пуовныоflмуи пттуи пвмШ?в 30 нс (уукнл 1-3). љмл мв лт~вбъ фл уЧ,овмлл лм,,лЧлъу фуъвб л лм,,лЧлъу лЧумыновб (ммРв мв фвтъ,овмР) л фу бпвы тууъ,вътъ,ыъ фуолфвфълп, бнулу,ммРп , ъуи кв пнв, ~ъу л 40, му м~лмлптfl т ,мыъвммлi AUG-нууму,. јл ъмтоfl^лл пњїє FL ъл фуынъР уътыътъ,ыъ (лт. 1Ч, уукнл 4-6). §нлп уЧбуп, фл ъмтоfl^лл пњїє LL2 , ѓњє т лтфуоШбу,млвп тъмъму,,у фуъунуо ,Рfl,овм fl фуынъу, Чвмъмуи лмл^л^лл т ,мыъвммлi AUG-нууму, фв,уи пнл т~лъР,млfl. јуiуклв фуынъР мЧоол л ы,,лв ,ъуР фл ъмтоfl^лл пњїє L1 , ѓњє [4], му лi фултiуквмлв млнн мв уЧтыкоутШ. љмну , кл,уи новънв, ту,,отму олъвъымРп ммРп, фууЧмРi фуолфвфълу, мв уЧмыкл,вътfl [4, 5]. ћову,ъвоШму, тлтъвп ѓњє , вв ноттл~втнуп ,лмъв мв ,утфулб,улъ ытоу,лfl кл,уи новънл, тнувв ,тв,,у, фу фл~лмв ,Р?выфупflмыъуи тфв^лолб^лл вълныоу^лъу,, тоыклi пъвлоуп оfl фл,,уъу,овмлfl нтънъ. №б,втъму, мфлпв, ~ъу , ѓњє у,уоШму Чвму фвтъ,овмР пњїє-т,flбР,лв Чвонл, мвуЧiулпРв оfl щщвнъл,муи ъмтоfl^лл мвнуъуРi ,лытмРi пњїє [6-8]. єупв ъу,,у, fl лттову,ъвови, лбы~,?лi ъмтоfl^л пњїє мвнуъуРi флнум,лыту,, ънкв мЧоол , ъуи тлтъвпв тоы~л Чвмъмуи лмл^л^лл [9-12], , ъу ,впfl нн , нтънъi, фл,,уъу,овммРi лб ы,,лi новъун
ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 40 < 1 2006

LL2 FL LL2 Ч Fluc p40 Fluc Fluc FL нс 66 A50 A50

45 p40

31 p40Ч

1

2

3

4

5

6

22

њлт. 1. §мтоfl^лfl пњїє LL2 л FL , ѓњє. - ћiвп пњїє LL2 л FL. њпнл т~лъР,млfl фунбмР фflпуы,,уоШмлнпл, ~вмРп ^,въуп уЧубм~вмР ы~тънл футову,ъвоШмутъл въуъмтфубум. Ч - њлу,ъу,,щ т вбыоШъъуп ъмтоfl^лл , ѓњє. ћф, уъпв~вм пуовныоflмfl птт ту,,отму Чвону,Рп пнвп, нс; тов, - фуынъР ъмтоfl^лл LL2, ,,в "40Ч" - ЧвмъмРв фуынъР. суукнл: 1-3 - ъмтоfl^лfl пњїє LL2, 4-6 - ъмтоfl^лfl пњїє FL. єум^вмъ^лл пњїє: 1 л 4 - 12.5 мѕ, 2 л 5 - 25 мѕ, 3 л 6 - 50 мѕ.

(мфлпв, HeLa), лмл^л^лfl фуiуло мупоШму [9, 10, 12]. з ъу кв ,впfl, фу т,мвмл т ы,,лпл новъу~мРпл нтънъпл ѓњє лпввъ fl фвлпывтъ,: утъыфмутъШ, ,Ртуны щщвнъл,мутъШ л iуу?ы ,утфулб,улпутъШ вбыоШъъу,. јуъупы пР в?лол лтфуоШбу,ъШ , м?вп лттову,млл нупЧлмлу,ммы тлтъвпы, ,бfl, б утму,ы ѓњє л уЧ,л, , мв,,у уЧЧуъммРи плнунунну,уи мыновбуи S30-нтънъ новъун HeLa (20% v/v). јууЧмы нупЧлмлу,ммы тлтъвпы лтфуоШбу,ол , Чуъв [10] оfl лбы~вмлfl ъмтоfl^лл пњїє фуолу,лыт, умну ?луну,,у тфутъмвмлfl ум мв фуоы~ло. њвбыоШъъ ъмтоfl^лл , ънуи тлтъвпв фвтъ,овм м лт. 2. суЧ,овмлв нтънъ новъун HeLa фнъл~втнл мв тнбР,вътfl м щщвнъл,мутъл ъмтоfl^лл нумъуоШмуи пњїє FL (т,мл уукнл 1 л 2). љмну нълм ъмтоfl^лл пњїє LL2 (уукнл 3-6) фл уЧ,овмлл нтънъ

28 FL

сплълв, л . LL2 нс Fluc 66 Ч LL2imp

45 p40

p40Ч

31

1

2

3

4

5

6

22

1

2

3

њлт. 2. §мтоfl^лfl бол~мРi пњїє , тлтъвпi ѓњє л ѓњє + HeLa. - §мтоfl^лfl пњїє LL2 л FL. 1 - 25 мѕ FL , ѓњє, 2 - 25 мп FL , ѓњє + HeLa, 3 - 25 мѕ LL2 , ѓњє, 4-6 - LL2 , ѓњє + HeLa (12.5, 25 л 50 мѕ тууъ,вътъ,вмму). Ч - §мтоfl^лfl пњїє LL2imp , тлтъвпв ѓњє + HeLa. єум^вмъ^лл пњїє: 1 - 12.5 мѕ, 2 - 25 мѕ, 3 - 50 мѕ. љтъоШмРв уЧубм~вмлfl - нн м лт. 1.

новъун HeLa бм~лъвоШму лбпвмflвътfl. јвкв ,тв,,у, лт~вбъ фуынъР Чвмъмуи лмл^л^лл - ол?Ш фл пнтлпоШмуи (50 мѕ) лб ъвтълу,ммРi нум^вмъ^ли пњїє , ъуи уЧотъл мЧоътfl тоЧРв фуоутР (лт. 2, уукн 6). јутовмли щнъ пуквъ т,лвъвоШтъ,у,ъШ , фуоШбы ъу,,у, ~ъу б птнлу,млв тиъу, Чвмъмуи лмл^л^лл уъ,в~ъ лпвмму пњїє-т,flбР,лв Чвонл: фл фу,Р?вмлл нум^вмъ^лл пњїє тууъму?вмлв Чвоун : њїє фвъ, пњїє "бв,вътfl", л мвутъыфмРв мвв уЧотъл ,мыъл пуовныоР пњїє тъму,flътfl утъыфмРпл оfl лЧутуп. јууЧмРи щщвнъ пњїє-т,flбР,лi Чвону, мЧоол , Чуъв [13]: фл уЧ,овмлл лi , ѓњє ,вуflъмутъШ лмл^л^лл ъмтоfl^лл т ,мыъвммв,,у ы~тън Чл^лтъуммуи пњїє, ,,в мiулотfl тиъ ,мыъвммв,,у т,flбР,млfl лЧутупР (IRES), ыпвмШ?отШ, бъу ы,вол~л,отШ щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл 5'-нум^в,у,,у ^лтъум. ју-,ллпупы, , тоы~в пњїє LL2 мол~лв ЧвмъмРi фуынъу, ъмтоfl^лл уЧытоу,овму ъвп, ~ъу лб-б мупоШму,,у д-Чу,,ъу,,у тутъ, фнъл~втнл ,тfl уЧотъШ фв,у,,у ^лтъум мiулътfl фвлпывтъ,вмму , уму^вфу~в~муи нумщуп^лл л , уътыътъ,лв пњїє-т,flбР,лi Чвону, пуквъ т,flбР,ъШ лЧутупы фууЧму уму^вфу~в~мупы U-Чу,,ъупы IRES-овпвмъы ,лыт RhPV [14] лол д-Чу,,ъРп IRES-овпвмъп ,лыт crTMV [15]. љмну фл уЧ,овмлл нтънъ новъун HeLa тувклвтfl , мвп пњїє-т,flбР,лв Чвонл уЧбыъ т пњїє лЧумыновуфуъвлмРв нупфовнтР, Чоунлыfl Чвмъмы ,мыъвмм лмл^л^л л мф,оflfl лЧутупР м

"ф,лоШмРв" тъъу,Рв нуумР - ъв, фуфмлв м нуъуРв уЧытоу,овму мол~лвп тфв^лщл~втнлi пвiмлбпу,. §у, ~ъу фл ъуп фнъл~втнл мв пвмflвътfl щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл пњїє FL л фв,у,,у ^лтъум пњїє LL2, нн б л т,лвъвоШтъ,ывъ у тывтъ,у,млл оfl млi ънлi пвiмлбпу,: , фв,уп тоы~в ъу м,вмflн ноттл~втнfl 5'-нумв^-б,лтлпfl лмл^л^лfl, ,у ,ъууп - олЧу ум кв, олЧу ы,,уи, вв мв ,РflтмвммРи, пвiмлбп. №м~в уЧтъулъ воу ту ,ъуРп ^лтъумуп пњїє LL2. јл уЧ,овмлл нтънъ HeLa щщвнъл,мутъШ в,,у ъмтоfl^лл тлоШму фвъ - iуъfl л мвтнуоШну , пвмШ?ви тъвфвмл, ~вп ЧвмъмРi фуынъу, (т,мл лмъвмтл,мутъл фуоут Fluc л p40Ч , уукнi 3 л 5 м лт. 2). зубпукму, ъу т,лвъвоШтъ,ывъ у ъуп, ~ъу , лтiумуп ѓњє лмл^л^лfl ъмтоfl^лл ,ъууи пнл , бм~лъвоШмуи тъвфвмл фултiулъ фу пвiмлбпы Чвмъму,,у ,мыъвммв,,у т,flбР,млfl лЧутупР, моу,,л~мупы ъну,упы оfl ы,,лi ,мыъвммлi AUG-нууму,. §вп мв пвмвв, ъуъ щнъ, ~ъу футов уЧ,овмлfl н ѓњє нтънъ новъун HeLa фуынъ Fluc мв лт~вбвъ ту,твп, ,,у,улъ у тывтъ,у,млл л ы,,у,,у пвiмлбп, уЧвтфв~л,в,,у лмл^л^л ъмтоfl^лл ,ъуу,,у ^лтъум, iуъfl щщвнъл,мутъШ ЧуъР ъу,,у пвiмлбп мв,Ртун. ћовывъ бпвълъШ, ~ъу тъуоШ млбнли ыу,вмШ ъмтоfl^лл ,ъуу,,у ^лтъум ,у,тв мв fl,оflвътfl мвуклммРп. з лтiумуи пњїє въуъмтфубум L1 ,ъууи ^лтъум нулывъ уЧъмы ъмтнлфъбы, ъуъ Чвоун мвуЧiулп въуъмтфубумы ,
ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 40 < 1 2006

дсцєзд§їд? ћ№ћ§цѕд сѓ? №ёќ?цї№? №ї№х№дх№№ §њдїћѓ?х№№ пњїє

29

у~вмШ мвЧуоШ?лi нуол~втъ,i. з кл,Рi новънi, фу-,ллпупы, нум^вмъ^лfl ъу,,у Чвон нимв мв,волн - кв тп щнъ в,,у мол~лfl , ънмfli л , новънi ныоШъыР ыоутШ фуъ,влъШ ол?Ш мв,му [16]. пњїє L1 тывтъ,ывъ , ^лъуфобпв , щупв лЧумыновуфуъвлмуи ~тъл^Р, , тутъ, нуъууи ,iулъ , утму,муп Чвоун 40 (фуынъ фв,уи пнл т~лъР,млfl) [17], л, iуъfl уЧъмfl ъмтнлфъб ънкв уокм ,iулъШ , тутъ, ълi пњїј (футнуоШны , ~тъл^i уЧмыкл,вътfl в,въбмfl нъл,мутъШ [18]), вв мол~лв ъп у тлi фу мв ыоутШ ,Рfl,лъШ кв т фупуШ мълъво. јвфуо,,вътfl, ~ъу , тутъ, пњїј ,iулъ ол?Ш ,в лол кв ум пуовныо в,въбР [19], , ъу ,впfl нн нуол~втъ,у пуовныо p40 , мви, фу-,ллпупы, ,втШп ,волну. слтфуфу^лfl , тууъму?вмлл нуол~втъ, тъынъыму,,у Чвон л фуолпвбР iнъвм оfl пму,,лi ,лытмРi ~тъл^. љ~вмШ ~тъу ъ лтфуфу^лfl ,Рб,м лпвмму бол~лвп , щщвнъл,мутъл лмл^л^лл ъмтоfl^лл. № iуъfl въуъмтфубумР л мв fl,оflътfl ,лытпл , фflпуп фумлпмлл ъу,,у тоу,, мвнуъуРв тфвнъР клбмвмму,,у ^лно умflъ лi, , ~тъмутъл, т фвтъ,лъвоflпл твпвитъ, Retroviridae [1]. з тууъ,вътъ,лл т ълпл фвфуоуквмлflпл, фл ъмтщвн^лл пњїє LL2 , новъу~мРв ныоШъыР мЧовпРи ыу,вмШ нъл,мутъл ,ъуу,,у ^лтъум ънкв унботfl нимв мв,Ртунлп (сплълв, ћ.ц., мвуфыЧолну,ммРв ммРв). соfl унбъвоШтъ, ъу,,у, ~ъу ,ъууи ^лтъум тфв^лоШму бфу,,пплу,м м млбны щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл фу тфв^лщл~втнупы пвiмлбпы, уъол~мупы уъ Чвмъмуи лмл^л^лл м ы,,лi ,мыъвммлi AUG-нуумi, пР в?лол уЧлъШтfl фу,Р?вмлfl ыу,мfl в,,у нтфвттлл , тлтъвпв ѓњє + HeLa. љм лб фл~лм млбну,,у ыу,мfl лмл^л^лл пу,,о ЧРъШ т,flбм т мвуфълпоШмРп мыновуълмРп нумъвнтъуп тъъу,у,,у AUG-нуум (atcataATGaca), фуъупы ЧРо тубм нумтъын^лfl pLL2imp, , нуъууи нумъвнтъ ЧРо бпвмвм м уфълпоШмРи (gccgccATGgat), ту,,отму [20, 21]. јуоы~вммы м утму,в ъуи нумтъын^лл пњїє LL2imp ъмтолу,ол , тлтъвпв ѓњє + HeLa. њвбыоШъъ ъмтоfl^лл фвтъ,овм м лт. 2Ч. ѕукму ,лвъШ, ~ъу лбпвмвмлв нумъвнтъ тлоШму фу,Ртлоу щщвнъл,мутъШ лмл^л^лл ъмтоfl^лл ,ъуу,,у ^лтъум (т,мл уукнл 1-3 м лт. 2Ч л уукнл 4-6 м лт. 2), л фл ыпввммРi нум^вмъ^лfli пњїє LL2imp фуынъуп вн^лл fl,оflътfl , пкумРi фуолфвфъл (Fluc л 40), , ъу ,впfl нн ЧвмъмРв фуынъР лмл^л^лл м ы,,лi ,мыъвммлi AUG (пму,,лв лб нуъуРi лбм~оШму мiулолтШ , нумъвнтъв, у~вмШ Чолбнуп н уфълпоШмупы), фнъл~втнл мв ,лмР (уукнл 1, 2). §нлп уЧбуп, , бЧуъммуи мпл тлтъвпв тфв^лщл~втнлв пвiмлбпР лмл^л^лл ъмтоfl^лл пњїє въуъмтфубум L1 Чуъъ щщвнъл,му, , ъу ,впfl нн Чвмъмfl лмл^л^лfl фнъл~втнл уътыътъ,ывъ. §у~мутъШ ъмтоfl^лл л
ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 40 < 1 2006

тууъму?вмлв вв фуынъу, ,,убу ЧуоШ?в тууъ,вътъ,ыъ тлъы^лл in vivo, ~вп фл лтфуоШбу,млл лтiуму,,у ѓњє. ї м? ,б,,оfl, ,Ртунfl ,вуflъмутъШ мол~лfl ъвщнъу, , тлтъвпв ъмтоfl^лл in vitro , ѓњє, лбы~вммfl мпл м флпвв пњїє L1 л бпв~вммfl мвв ы,,лпл ,ъупл м флпвв пњїє флнум,лыту, [9-12], уЧflбъвоШму уокм ы~лъР,ъШтfl фл лтфуоШбу,млл ммуи тлтъвпР оfl лбы~вмлfl пвiмлбпу, Члутлмъвб Чвон. ѓњє лвоШму фуiулъ оfl фу,внл олмР л ^воутъмутъл пун т~лъР,млfl, оfl фуоы~вмлfl пв~вмРi внупЧлммъмРi Чвону, л мвнуъуРi ы,,лi ^вови ъвiмл~втну,,у iнъв, умну лттову,млв пвiмлбпу, лмл^л^лл ъмтоfl^лл, , утуЧвммутъл , тоы~в пњїє т фуъflквммРпл уму^вфу~в~мРпл ы~тънпл, ъвЧывъ лмРi фуiуу,. љлм лб млi фвоуквм , ммуи тъъШв. д,ъуР ,Ркъ лтнвмм флбмъвоШмутъШ №.ї. ?ътнупы б уЧтыквмлв ЧуъР л б фвутъ,овмлв S30-нтънъ новъун HeLa, й. ћ,в,,уоы - б фобплы p3LZ. њЧуъ ,Рфуомвм фл фувкнв њуттлитну,,у щум щымпвмъоШмРi лттову,мли (04-0449507) л щум Fogarty International Research Collaboration Award (FIRCA PA-02-057). ћј№ћљє ѓ№§цњд§ќњ?
1. Ostertag E.M., Kazazian H.H., Jr. 2001. Biology of mammalian L1 retrotransposons. Annu. Rev. Genet. 35, 501-538. 2. Pelham H.R., Jackson R.J. 1976. An efficient mRNAdependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem. 67, 247-256. 3. Sambrook J., Russell D. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. 3d Ed. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 4. Leibold D.M., Swergold G.D., Singer M.F., Thayer R.E., Dombroski B.A., Fanning T.G. 1990. Translation of LINE-1 DNA elements in vitro and in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 6990-6994. 5. McMillan J.P., Singer M.F. 1993. Translation of the human LINE-1 element, L1Hs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 11533-11537. 6. Meerovitch K., Svitkin Y.V., Lee H.S., Lejbkowicz F., Kenan D.J., Chan E.K., Agol V.I., Keene J.D., Sonenberg N. 1993. La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate. J. Virol. 67, 3798-3807. 7. Hunt S.L., Hsuan J.J., Totty N., Jackson R.J. 1999. unr, a cellular cytoplasmic RNA-binding protein with five cold-shock domains, is required for internal initiation of translation of human rhinovirus RNA. Genes Dev. 13, 437-448. 8. Jia X.Y., Scheper G., Brown D., Updike W., Harmon S., Richards O., Summers D., Ehrenfeld E. 1991. Translation of hepatitis A virus RNA in vitro: aberrant internal initiations influenced by 5' noncoding region. Virology. 182, 712-722.

30

сплълв, л . Atabekov J.G. 2002. Polypurine (A)-rich sequences promote cross-kingdom conservation of internal ribosome entry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 5301-5306 Ergun S., Buschmann C., Heukeshoven J., Dammann K., Schnieders F., Lauke H., Chalajour F., Kilic N., Stratling W.H., Schumann G.G. 2004. Cell type-specific expression of LINE-1 open reading frames 1 and 2 in fetal and adult human tissues. J. Biol. Chem. 279, 27753-27763. Hohjoh H., Singer M.F. 1996. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639. Deragon J.M., Sinnett D., Labuda D. 1990. Reverse transcriptase activity from human embryonal carcinoma cells NTera2D1. EMBO J. 9, 3363-3368. Ostertag E.M., Kazazian H.H. Jr. 2001. Twin priming: a proposed mechanism for the creation of inversions in L1 retrotransposition. Genome Res. 11, 2059-2065. Kozak M. 1987. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950. Grunert S., Jackson R.J. 1994. The immediate downstream codon strongly influences the efficiency of utilization of eukaryotic translation initiation codons. EMBO J. 13, 3618-3630.

9. Brown B.A., Ehrenfeld E. 1979. Translation of poliovirus RNA in vitro: changes in cleavage pattern and initiation sites by ribosomal salt wash. Virology. 97, 396-405. 10. Dorner A.J., Semler B.L., Jackson R.J., Hanecak R., Duprey E., Wimmer E. 1984. In vitro translation of poliovirus RNA: utilization of internal initiation sites in reticulocyte lysate. J. Virol. 50, 507-514. 11. Dasso M.C., Jackson R.J. 1989. On the fidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbit reticulocyte lysate system. Nucleic Acids Res. 17, 3129-3144. 12. Jackson R.J. 1991. Potassium salts influence the fidelity of mRNA translation initiation in rabbit reticulocyte lysates: unique features of encephalomyocarditis virus RNA translation. Biochim. Biophys. Acta. 1088, 345-358. 13. Svitkin Y.V., Ovchinnikov L.P., Dreyfuss G., Sonenberg N. 1996. General RNA binding proteins render translation cap dependent. EMBO J. 15, 7147-7155. 14. Terenin I.M., Dmitriev S.E., Andreev D.E., Royall E., Belsham G.J., Roberts L.O., Shatsky I.N. 2005. A crosskingdom internal ribosome entry site reveals a simplified mode of internal ribosome entry. Mol. Cell. Biol. 25, 7879-7888. 15. Dorokhov Y.L., Skulachev M.V., Ivanov P.A., Zvereva S.D., Tjulkina L.G., Merits A., Gleba Y.Y., Hohn T.,

16.

17. 18. 19. 20. 21.

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 40 < 1 2006