Фюъѓьхэђ тчџђ шч ъ§јр яюшёъютющ ьрјшэћ. Рф№хё ю№шушэрыќэюую фюъѓьхэђр : http://www.genebee.msu.ru/LPSR/Dmitriev_MolBiol2003.pdf
Фрђр шчьхэхэшџ: Sun Nov 30 18:25:10 2008
Фрђр шэфхъёш№ютрэшџ: Tue Oct 2 01:31:39 2012
Ъюфш№ютър: ISO8859-5

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№?, 2003, ъуп 37, < 3, т. 494-503

ѕљѓцєќѓ?њї?ц ѕцџдї№ёѕ? е№љѓљй№?цћє№џ јњљхцћћљз
ќсє 577.217.52

їцёїд?№§цѓ?ї?ц здњ№дх№№ з§љњ№?їљђ ћ§њќє§ќњ? 5'-їц§њдїћѓ№њќцѕљђ љеѓдћ§№ пњїє b-йѓље№їд №ёѕцї??§ §њцељздї№? є єљїхцї§њдх№№ ўдє§љњд №ї№х№дх№№ eIF2
? 2003 ,,. ћ. ц. сплълв,, №. ѕ. §ввмлм, ѕ. ј. њыЧ^у,, №. ї. ?ътнли*
їы~му-лттову,ъвоШтнли лмтълъыъ щлблну-iлпл~втнуи Члуоу,,лл лп. д.ї. евоубвтну,,у ѕутну,тну,,у ,,утытъ,вмму,,у ымл,втлъвъ лп. ѕ.з. ѓупумуту,, ѕутн,, 119899
јутъыфло , вн^л 24.09.2002 ,,.

№бпвмвмлfl , мыновуълмуи футову,ъвоШмутъл 5'-мвъмтолывпуи уЧотъл пњїє -,,оуЧлм, ы,вол~л,лв ~лтоу тфвммРi утму,мли Чвб фуfl,овмлfl тъЧлоШмРi ,ъул~мРi тъынъы, тоЧу ,олflъ м щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл ъуи пњїє , олбъв вълныоу^лъу, нуолн фл вв млбнуи нум^вмъ^лл, му вбну тмлкъ щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл фл ,Ртунлi нум^вмъ^лfli. ќовмлв тфвммРi ы~тъну, ,уттъм,ол,въ iнъв ъмтоfl^лл. суЧ,овмлв , олбъ у~лвмму,,у ынлуъл~втну,,у щнъу лмл^л^лл eIF2 фл,улъ н олн,л^лл бол~ли , ъмтоfl^лл пъл^ т бмуи ,ъул~муи тъынъыуи 5'-мвъмтолывпуи уЧотъл. дмоу,,л~мРи щщвнъ уЧвтфв~л,въ 50, ,,о,мРи Чвоун пњїј. суЧ,овмлв ы,,лi пњїє-т,flбР,лi лмл^лъумРi щнъуу, - eIF4F л eIF4B - мв тнбР,вътfl м б,лтлпутъл щщвнъл,мутъл ъмтоfl^лл уъ нум^вмъ^лл пњїє. јл фупул тлтъвпР тЧунл 48S лмл^лъуму,,у нупфовнт лб у~лвммРi нупфумвмъу, фунбму, ~ъу оfl пнтлпоШмуи щщвнъл,мутъл лмл^л^лл ъмтоfl^лл лтiумуи пњїє -,,оуЧлм мвуЧiулпу пвмШ?в eIF2, ~вп оfl вв фулб,умуи, тувкви , 5'-мвъмтолывпуи уЧотъл тоЧРв ,ъул~мРв тъынъыР. јвоуквм пувоШ, ту,,отму нуъууи eIF2, фуплпу утъ,нл ѕвъ-ъњїє, ,Рфуомflвъ щымн^л щнъу, тъЧлолблыв,,у ,блпувитъ,лв 40S тыЧ~тъл^Р лЧутупР т 5'-мвъмтолывпуи уЧотъШ пњїє, ~ъу утуЧвмму ,кму фл лмл^л^лл ъмтоfl^лл м пъл^i ту тъынъылу,ммРпл 5'-мвъмтолывпРпл уЧотъflпл. єо~в,Рв тоу,: лмл^л^лfl ъмтоfl^лл, пњїє -,,оуЧлм, ,ъул~мfl тъынъы пњїє, 5'-мвъмтолывпfl уЧотъШ, щнъу лмл^л^лл eIF2, внумтъын^лfl 48S лмл^лъуму,,у нупфовнт, повнуфлълв.

с, но~в,Рi ъф , лмл^л^лл ъмтоfl^лл - ъу т,flбР,млв поуи лЧутупмуи 40S тыЧ~тъл^Р т лмл^лъумуи ѕвъ-ъњїє л "футн" тыЧ~тъл^Р м пњїє. јв,Ри ъф ы ынлуъ утывтъ,оflвътfl т фупуШ ъвiтыЧвлмл~му,,у щнъу лмл^л^лл eIF2, уЧбыв,,у ъуимуи нупфовнт eIF2 Ч GTP Ч ѕвъ-ъњїє. зъууи ъф нъолблывътfl пњїє-т,flбР,лпл щнъупл eIF4F, eIF4A л eIF4B, нуъуРв тфовъъ ,ъул~мРв тъынъыР , олвв (5'-ї§љ) пњїє л, ,убпукму, уЧвтфв~л,ъ ,лквмлв 40S тыЧ~тъл^Р уъ 5'нум^ пњїє н AUG-нуумы. ївтпуъfl м ъу, ~ъу тъувмлв л щымн^лл нку,,у лб ълi Чвону, iуу?у лбы~вмР, пувоШ, уфлтР,fl фу^втт лмл^л^лл ъмтоfl^лл , ^воуп (тп., мфлпв, уЧбуР [1, 2]), утъ,оflвъ пму,,у уънРъРi ,уфујлмflъРв тунвмлfl: 5'-ї§љ - 5'-мвъмтолывпfl уЧотъШ, §?ѓ - ъвi~тъмРи олв, јхњ - фуолпвбмfl ^вфмfl вн^лfl, љ§-јхњ - уЧъмfl ъмтнлф^лfl-фуолпвбмfl ^вфмfl вн^лfl, DMS - лпвълотыоШщъ, ћѕћ§ - 1-^лноу,,внтло-3-(2-пущуолму-ъло)-нЧуллпл пвъу-p-ъуоыуотыоШщумъ, GMPPNP - ,,ымублм-5'-[,-лплу]ълщутщъ, DTT - лълуъвлъуо, GFP - бвовмРи щоыувт^вмъмРи Чвоун. *?о. фу~ъ: shatsky@libro.genebee.msu.su

ту,. з ~тъмутъл, у~вмШ поу лб,втъму у ъуп, нн тууъмутflътfl ы,, т ы,,уп , ъф лмл^л^лл: мвб,лтлпР ол умл, нну, лi футову,ъвоШмутъШ л мтнуоШну квтъну ум въвплмлу,м. ївнуъуРв ммРв [3, 4] фуб,уоflъ фвфуоуклъШ, ~ъу ,блпувитъ,лв ъуиму,,у нупфовнт т 40S тыЧ~тъл^ви мутлъ iнъв тту^л^лл-лтту^л^лл, л т,flбР,млв тъму,лътfl тъЧлоШмРп ол?Ш фл утълквмлл тнмлыви лЧутупуи AUG-нуум Чо,,уfl тфл,мл утму,мли т мълнуумуп ъњїє. зблпувитъ,лв 40S тыЧ~тъл^Р т пњїє ънкв, тнувв ,тв,,у, мв fl,оflвътfl мвуЧълпРп фу^вттуп, фл~вп тъЧлоШмутъШ тту^л^лл мiулътfl , уЧъмуи б,лтлпутъл уъ тъЧлоШмутъл ,ъул~мРi тъынъы , 5'-ї§љ [5]. №тiуfl лб ънуи пувол лмпл~втнлi ,блпувитъ,ли нупфумвмъу, лмл^л^лл, пукму ,РтнбъШ фвфуоуквмлв, ~ъу пъл^Р т Чуовв тъынъылу,ммРпл 5'-ї§љ уокмР лпвъШ фу,Р?вммРв ъвЧу,млfl н нуол~втъ,ы щнъуу, лмл^л^лл л ЧРъШ ~ы,тъ,лъвоШмРпл н ыпвмШ?вмл лi нум^вмъ^лл. јутнуоШны пму,,лв щнъуР уЧоъ у~вмШ тлоШмРпл пњїє-т,flбР,лпл т,уитъ,пл [6-8], фл ы,вол~вмлл нуол~втъ, пњїє , тлт-

494

їцёїд?№§цѓ?ї?ц здњ№дх№№ з§љњ№?їљђ ћ§њќє§ќњ?

495

ъвпв щщвнъл,мfl нум^вмъ^лfl ълi щнъуу, фвъ, л ,вуflъмутъШ лмл^л^лл м ънлi тъынъылу,ммРi пъл^i ыпвмШ?вътfl - лмРпл тоу,пл, пњїє м~лмвъ лм,,лЧлу,ъШ туЧтъ,вммы ъмтоfl^л. ўвмупвм лм,,лЧлу,млfl пъл^ви туЧтъ,вммуи ъмтоfl^лл лб,втъвм утъъу~му ,му [9, 10], л в,,у уЧflтмвмлв ",Рълъу,Р,млвп" щнъу (щнъуу,) лмл^л^лл ЧРоу фвоуквму фнъл~втнл тбы [10, 11]. љмну ,у ,твi ълi Чуъi лттову,ъвол лпвол воу т тыппмРпл фвфъпл пњїє, фуъупы мв пу,,ол ,Рfl,лъШ лмл,лыоШмРв бол~лfl пъл^. §нкв мв ЧРо умубм~му ытъму,овм нупфумвмъ ффъ ъмтоfl^лл, тмлквмлв нум^вмъ^лл нуъуу,,у фл,улоу н уфлтммупы щщвнъы, л мв ЧРо фвоуквм пвiмлбп, уфлтР,ли ммРи щвмупвм. з мтъуflви Чуъв фунбму, ~ъу фулб,умРв -,,оуЧлму,уи пњїє т мвбм~лъвоШмРпл ,л^лflпл ,у ,ъул~муи тъынъыв 5'-ї§љ уЧоъ флм^лфлоШму бмуи тфутуЧмутъШ фу,оflъШ туЧтъ,вммы ъмтоfl^л, умну ъл бол~лfl пукму ытъмлъШ, ы,вол~л, нуол~втъ,у eIF2 , тлтъвпв. ћ фупуШ пвъу внумтъын^лл 48S лмл^лъумРi ъмтоfl^луммРi нупфовнту, лб у~лвммРi нупфумвмъу, фунбму, ~ъу ы пъл^, тувклi ,ъул~мРв тъынъыР , 5'-ї§љ, фу,Р?вмР ъвЧу,млfl н нум^вмъ^лл eIF2. ќћѓљз№? ?єћјцњ№ѕцї§д јл нумтъылу,млл фобпл лтфуоШбу,ол ?ъпп Escherichia coli JM109 л ,внъуР твлл pUC18. њЧуъР т фобплпл л ,,вмму-лмквмвмРв пмлфыоfl^лл фу,улол ту,,отму [12]. нсїє -,,оуЧлм фуоы~ол т фупуШ уЧъмуи ъмтнлф^лл-фуолпвбмуи ^вфмуи вн^лл (љ§-јхњ) м тыппмуи фуол(д)+ пњїє, ,Рвовммуи лб вълныоу^лъу, нуолн [13] т лтфуоШбу,млвп фипву, ACACTTGCTTTTGACACAAC л TTACGAGCTCAAGGGGCTTCATG, в,въбР AMV ("Promega") л сїє-фуолпвбР Taq ("Fermentas"). ћ фупуШ јхњ фвв ы~тънуп, тууъ,вътъ,ылп 5'-ї§љ -,,оуЧлму,уи пњїє, ,,улол фупуъу њїє-фуолпвбР щ,, §7. јхњ-фуынъ ол,,лу,ол , фобплы pUC18 фу ы~тънп KpnI-Ecl136II, бъвп щ,,пвмъ BalI-Ecl136II нсїє -,,оуЧлм бпвмflол ы~тънуп, нулылп фуомубпвмРи Чвоун GFP, фуоы~вммРп т фупуШ јхњ м фобплв pGFP-C2 ("CLONTECH") т фипвпл CCATGGGTAAAGGAG л CTCTTACTTGTATAGTTCATCCA. єумв~мы нумтъын^л bG лтфуоШбу,ол оfl фуоы~вмлfl тууъ,вътъ,ыви пњїє. §нлп уЧбуп, пњїє bG олмуи 1192 м. тутъуflо лб 5'-ї§љ л фв,Рi 415 м. нулыви ~тъл пњїє -,,оуЧлм т флтувлмвммРп н млп щ,,пвмъуп, нулылп Чвоун GFP. јуынъ ъмтоfl^лл пњїє bG лпво птты унуоу 42 нс, ~ъу ыуЧму оfl фу,ввмлfl овнъущувъл~втну,,у молб. єумтъын^лл

TbG л bTbG фуоы~ол лб bG уол,,умыновуълмф,овммРп пыъ,,вмвбуп (мЧу GeneEditor, "Promega"). №тфуоШбу,ол уол,,умыновуълР GTAATACGACTCACTATAGGACTCTCTTCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGAGCTTACTTGCAATCCC л GCTTTTGACACAACTGTGTACTCTCTTCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGAGCTTACTTGCAATCC тууъ,вътъ,вмму. дмоу,,л~му лб TbG т лтфуоШбу,млвп фипву, CTTCGCATCGCTAAGCTTACTTGCAATCCC л GTCTGCGAGGGCCAGAATGGTGCATCTGTCC фуоы~ол Td1bG л Td2bG тууъ,вътъ,вмму. њїє фуоы~ол т фупуШ §7-ъмтнлф^лл т нуъмтнлф^луммРп нвфлу,млвп. њвн^л фу,улол , 20 пно тпвтл, тувкви 80 пѕ Hepes-KOH, pH 7.4, 12 пѕ Mg(CH3COO)2, 2 пѕ тфвпллм, 10 пѕ DTT, фу 10 пѕ ATP, UTP л CTP, 5 пѕ m7GpppGTP ("Pharmacia"), 5 пн,, сїє, олмвлбу,ммуи фу ы~тъны Ecl136II, 20 в.нъ. лЧумыновбму,,у лм,,лЧлъу HPRI ("Fermentas") л 20 в.нъ. њїє-фуолпвбР щ,, §7 ("Fermentas"). јутов фвРмныЧ^лл фл 37Рћ , ъв~вмлв 5 плм уЧ,оflол GTP у нум^вмъ^лл 0.5 пѕ л лмныЧлу,ол вв 1 ~. сїє бы?ол уЧЧуънуи 3 пно RQ DNase ("Promega") , ъв~вмлв 5 плм. јутов щвмуоШмуи вфуъвлмлб^лл вн^луммы тпвтШ у~лол уъ туови л мыновуълу, ,,воШщлоШъ^лви м твщвнтв G50, њїє уткол ъмуоуп л тъ,уflол , ,ув. соfl ъмтоfl^лл лтфуоШбу,ол уЧЧуъммРи мыновбуи олбъ вълныоу^лъу, нуолн щлпР "Promega". њвн^луммfl тпвтШ тувко 4.3 пно олбъ, уфуомвмму,,у тпвтШ плмунлтоуъ л [35S]пвълумлмуп ("Amersham") ту,,отму внупвм^лл лб,,уъу,лъвоfl, л 1.7 пно ,уму,,у тъ,у пњїє бмуи нум^вмъ^лл. ?овнъущувб фуынъу, ъмтоfl^лл фу,улол фу ѓппол , 12%-муп фуолнлоплмуп ,,вов [12]. њвнумтъын^л 48S лмл^лъумРi нупфовнту, фу,улол ту,,отму [14] т мвЧуоШ?лпл пулщлн^лflпл. зпвтъу тыппмуи мъл,муи ъњїє оfl фуоы~вмлfl ѕвъ-ъњїє лтфуоШбу,ол лтныттъ,вммы лмл^лъумы ъњїєѕвъ, тлмъвблу,ммы §7-ъмтнлф^лви фобплР pTRM1 (тп. [15]). єум^вмъ^лfl 40S тыЧ~тъл^ лЧутуп тутъ,оflо 250 мѕ. њвнупЧлммъмРв Чвонл eIF1 л eIF1A ,Рвоflол лб E. coli м ,,убв Ni-NTA ("Qiagen") фу пвъулнв лб,,уъу,лъвоfl. eIF2, eIF3, eIF4A л eIF4B ,Рвоflол лб олбъ вълныоу^лъу, нуолн ту,,отму [16], eIF4F - лб олбъ новъун HeLa [17]. eIF4F футов iупъу,,щлл м m7G-твщубв оfl фуому,,у ыовмлfl m7GTP лолбу,ол фуъл, Чыщв, тувкв,,у 1 ѕ KCl. зтв фвфъР щнъуу, ЧРол нъл,мР, футнуоШны , уътыътъ,лв оЧу,,у лб млi тЧунл нупфовнт мв фултiулоу (ммРв мв фл,ввмР). јвфъ Чвон 50 оЧвбму фвутъ,овм ѓ.ј. љ,~лммлну,Рп. љЧъ-

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003

496

сѕ№§њ№цз л .

мы ъмтнлф^л фу,улол т фипв Shin18, TCACCACCAACTTCTTCCAC, нупфовпвмъму,,у ы~тъны 61-80 м. нулыви ~тъл пњїє ,,оуЧлм. №тфуоШбу,ол уЧъмы ъмтнлфъбы AMV ("Promega"). №мъвмтл,мутъШ тл,,моу, м лу,ъу,,щi ,,вови у^вмл,ол т фупуШ фу,,ппР ImageQuant 5.0. ёумлу,млв ,ъул~муи тъынъыР пњїє фу,улол , ытоу,лfli, моу,,л~мРi ытоу,лflп тЧунл 48S лмл^лъумРi нупфовнту,, , Чыщвв, тувквп 20 пѕ Tлт-HCl, pH 7.4, 80 пѕ KCH3COO, 2.5 пѕ Mg(CH3COO)2, 0.1 пѕ EDTA, 1 пѕ DTT, 0.25 пѕ тфвпллм, 1 пѕ ATP л 0.4 пѕ GTP. 1 фпуоШ пњїє лмныЧлу,ол 10 плм фл 30Рћ , 20 пно Чыщв, футов ~в,,у уЧ,оflол олЧу 1 пно т,вквфл,,уъу,овмму,,у 10%-му,,у тфлъу,у,,у тъ,у DMS, олЧу 10 пно т,вквфл,,уъу,овмму,,у тъ,у ћѕћ§ , Чыщвв, олЧу 0.1 в.нъ. њїєбР T1 лол 0.3 в.нъ. њїєбР T2 ("Pharmacia"). јл лтфуоШбу,млл DMS тпвтШ лмныЧлу,ол 5 плм, , утъоШмРi тоы~fli - 20 плм. ју унум~млл вн^лл н тпвтл уЧ,оflол 1/4 уЧвп тъ,у SP (1.5 пѕ CH3COONa pH 5.0, 1 ѕ -пвнфъуъмуо, 0.1 пѕ EDTA) л 5 пн,, 18S њїє , н~втъ,в туутлъвоfl. њїє нтъ,,лу,ол щвмуо-iоуущупмуи тпвтШ л уткол ъвпfl уЧвппл ъмуо. љтун тъ,уflол , 10 пно тпвтл, тувкви 5 фпуоШ пв~вмму,,у 32њ фипв Shin18, 5 пѕ нку,,у лб dNTP, 5 в. нъ. HPRI, 40 в. нъ. в,въбР MMLV ("Helicon") л 2 пно 5i Чыщв оfl M-MLV. №мныЧлу,ол 30 плм фл 30Рћ. њїє нтъ,,лу,ол щвмуо-iоуущупмуи тпвтШ, уткол ъмуоуп л тъ,уflол , 4 пно Stop Solution лб мЧу щлпР "USB" оfl твн,вмлу,млfl. сїє твн,вмлу,ол фу ћм,,вы [12] т фупуШ мЧу щлпР "USB". ?овнъущувб сїє , вмъылылi ытоу,лfli фу,улол , 6%-муп фуолнлоплмуп ,,вов т 7 ѕ пу~в,лмуи. њцёќѓ?§д§? № љећќьсцї№ц њбол~лfl , лм,,лЧлу,млл пъл^пл туЧтъ,вммуи ъмтоfl^лл лбы~ол м фflъл пњїє, нуъуРв уъол~олтШ ъуоШну 5'-фунтлпоШмРпл ы~тънпл 5'-ї§љ, фл~вп бол~лfl бъ,,л,ол мв Чуовв 3% олмР пњїє. єулыfl ~тъШ, ънкв 28 м. олв, флпРнлв н AUG-нуумы, ЧРол улмну,Рпл ы ,твi пњїє (б лтно~вмлвп Td2bG, тп. млкв). §нлп уЧбуп, ,тв бол~лfl , ъмтоfl^лл ълi пњїє пу,,ол уЧflтмflъШтfl ъуоШну бол~муи щщвнъл,мутъШ лмл^л^лл, фл~вп лвмъл~мутъШ нумъвнтъу, тъъу,Рi нууму, фуб,уоло лбы~ъШ мм тъл лмл^л^лл, лпвмму, фв,л~мув т,flбР,млв 40S тыЧ~тъл^Р лЧутупР т 5'-нум^уп пњїє л ,тв, ~ъу фултiулъ у утълквмлfl тыЧ~тъл^ви уЧотъл AUG-нуум. ћъЧлоШмутъШ кв щлмоШму,,у 48S нупфовнт, ънкв нлмвълн флтувлмвмлfl ЧуоШ?уи

тыЧ~тъл^Р, оум,,^лfl л ъвплм^лfl м ,твi пъл^i уокмР ЧРъШ улмну,Рпл. їыновуълмРв футову,ъвоШмутъл пњїє фл,ввмР м лт. 1Ч. bG cувко 5'-ї§љ пњїє ,,оуЧлм. пњїє TbG уъол~отШ уъ мвв бпвмуи фв,Рi 25 м. м 35 5'-нум^в,Рi мыновуълу, олв фубмлi вму,лытмРi пњїє (ъвi~тъму,,у олв, §?ѓ, , нуъууп ъл 35 м. мiуflътfl , уму^вфу~в~муи нумщуп^лл [18]). пњїє bTbG cувко -,,оуЧлму,ы 5'-ї§љ ту ,тъ,нуи ъу,,у кв ы~тън §?ѓ , фуоуквмлв 25. §нлп уЧбуп, уъ TbG ум уъол~отШ 5'-нум^уп, уъ bG - тввлмуи 5'-ї§љ. з Td1bG фв,Рв 25 м. пњїє -,,оуЧлм бпвмвмР 17 5'-нум^в,Рпл мыновуълпл §?ѓ, , Td2bG ,пвтъу -,,оуЧлму,у,,у олв мiуflътfl 35 5'-нум^в,Рi мыновуълу, §?ѓ. §нлп уЧбуп, 5'-ї§љ фflъл пњїє бол~олтШ тъынъыуи л - , пвмШ?ви тъвфвмл - олмуи. зтв пњїє ъмтолу,ол , уЧЧуъммуп мыновбуи олбъв вълныоу^лъу, нуолн т уЧ,овмлвп [35S]пвълумлм, фл~вп лтфуоШбу,ол ,убтълв нум^вмъ^лл пњїє. ју унум~млл ъмтоfl^лл вн^луммРв тпвтл бвоflол т фупуШ овнъущувб , фуолнлоплмуп ,,вов т ув^лотыоШщъуп мълfl, ,,вол лу,ъу,,щлу,ол л у^вмл,ол щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл т фупуШ щутщулплкв. єн пукму ,лвъШ лб лт. 2, пъл^Р, мвтпуъfl м мвбм~лъвоШмутъШ бол~ли , фв,л~муи тъынъыв, фл ъмтоfl^лл ,выъ твЧfl фу-бмупы. пњїє bG л Td1bG iуу?у ъмтолыътfl кв , тпРi ,Ртунлi лб фу,ввммРi нум^вмъ^ли (,фоуъШ у 170 пн,,/по), , ъу ,впfl нн утъоШмРв пњїє лпвъ flну ,РквммРи уфълпып , иумв 25 пн,,/по, фл фв,Р?вмлл нуъуу,,у щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл фвъ. №б т,мвмлfl фв,л~мРi тъынъы пњїє flтму, ~ъу уЧмыквммРи щщвнъ мв т,flбм мл т олмуи 5'-ї§љ (, пњїє Td1bG л Td2bG улмну,у нууънлв олвР, ы утъоШмРi пњїє олмР 5'-ї§љ бол~ътfl мвбм~лъвоШму), мл т мыновуълмуи футову,ъвоШмутъШ, мiуflвитfl мвфутвтъ,вмму м 5'-нум^в (ъл футову,ъвоШмутъл улмну,Р ы bG л bTbG л ы Td1bG, TbG л Td2bG). зРтнбму фвфуоуквмлв, ~ъу бол~лfl , ъмтоfl^лл т,flбмР ту ,ъул~мРпл тъынъыпл 5'-ї§љ пњїє. соfl фу,внл ъуи ,,лфуъвбР фу,ввму iлпл~втнув л щвпвмъъл,мув бумлу,млв ,ъул~мРi тъынъы 5'-фунтлпоШмРi ы~тъну, ъмтнлфъу, bG, TbG. bTbG л Td1bG. ї лт. 1 фвтъ,овмР вбыоШъъР, фуоы~вммРв т фупуШ лЧумыновбР §1 (бР,въ уму^вфу~в~мРв ы~тънл футов ,,ымлм) л лЧумыновбР §2 (,мутлъ мыновуъл-мвтфв^лщл~мРв бР,Р , уму^вфу~в~мРв ы~тънл), ънкв т фупуШ пулщл^лылi ,,вмъу, DMS л ћѕћ§, в,,лылi т мвтфвммРпл утму,млflпл вмлоу,Рi л ы^лоу,Рi утъъну, тууъ,вътъ,вмму. јутов в-

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003

їцёїд?№§цѓ?ї?ц здњ№дх№№ з§љњ№?їљђ ћ§њќє§ќњ? єумъуоШ њїєб T1, 0.1 в. њїєб T1, 0.3 в.

497

њїєб T2

TG CA

TG

CA

њїєб §1 њїєб §2 DMS CMCT Ч TbG bTbG

њїєб T1 55 м. 65 м. 90 м. 51 м. 35 м.

єумъуоШ

bG TbG bTbG Td1bG Td2bG

њлт. 1. њвбыоШъъР iлпл~втну,,у л щвпвмъъл,му,,у бумлу,млfl 5'-ї§љ ъмтнлфъу, bG, TbG, bTdG л Td1bG т фупуШ пулщл^лылi в,,вмъу, DMS (фу утъънп вмлм) л ћѕћ§ (фу ыллмы), ънкв ,,ымублм-тфв^лщл~муи њїєбР §1 л мвтфв^лщл~муи њїєбР §2, ,,луолбылi уму^вфу~в~мРв ы~тънл њїє. ёумлу,млв утъъну, ^лъублм мв фу,улол. - њлу,ъу,,щР т вбыоШъъпл бумлу,млfl 5'-ї§љ ъмтнлфъу, TbG л bTbG. Ч - їыновуълмРв футову,ъвоШмутъл 5'-фунтлпоШмРi ы~тъну, -,,оуЧлму,уи пњїє (bG) л вв фулб,умРi. ќ~тънл, уъмутflлвтfl н пњїє -,,оуЧлм, фунбмР клмРп. №мл^лъумРв AUG-нуумР фу~внмыъР. ќ~тъун TbG олмуи 15 м., уъол~ли вв уъ Td1bG, уъпв~вм нытл,уп. ћф, ынбмР олмР 5'-ї§љ пњїє.

н^лл пв~вммРи 32њ фипв уъкл,,ол т пњїє, фу,улол уЧъмы ъмтнлф^л л молблу,ол вв фуынъР т лтфуоШбу,млвп твн,вмлыв,,у ,,воfl (флпвР бумлу,млfl пњїє TbG л bTbG фвтъ,овмР м лт. 1). сммРв у утъыфмутъл утму,мли оfl пулщлн^лл фл,ввмР м лт. 1Ч. злму, ~ъу пњїє bG л Td1bG лпвъ уму^вфу~в~мРв олвР (Чоун UUUU , 5'-ї§љ пњїє bG, тнувв ,тв,,у, ънкв мiулътfl , уму^вфу~в~муи нумщуп^лл, му в,,у ън фу мвфумflъмРп фл~лмп бъымвм, молб утъыфму-

тъл фв,Рi 2 м. (GG) ,у ,твi пњїє тоуквм лб-б мв,убпукмутъл бол~лъШ м лу,ъу,,щв тл,,моР уъ GG л уъ фуомубпвмуи њїє). з ъу кв ,впfl ы утъоШмРi пњїє мвнуъуРв утму,млfl , 5'-ї§љ тфвмР, фл~вп , пњїє bTbG 5'фунтлпоШмfl ~тъШ олв мiулътfl , уму^вфу~в~муи нумщуп^лл, ,ъул~мРв тъынъыР оунолбу,мР ъуоШну , ^вмъоШмуи ~тъл. ѕвъу нупфШъвму,,у пуволу,млfl, умну, фунбо, ~ъу 5'-ї§љ TbG, bTbG л Td2bG мв тувкъ олммРi ,ыi^вфу~в~мРi ы~тъну,, л мву-

9 ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003

DMS ћѕћ§

498 љъмутлъвоШмfl щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл, % 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20

сѕ№§њ№цз л .

bG TbG Td1bG Td2bG bTbG

40

60 80 100 120 140 160 єум^вмъ^лfl пњїє, пн,, / по

њлт. 2. §мтоfl^лfl пњїє bG, TbG, bTbG, Td1bG л Td2bG , уЧЧуъммуп мыновбуи олбъв вълныоу^лъу, нуолн , флтыътъ,лл [35S]пвълумлм. №мъвмтл,мутъШ фуоут фуынъу, ъмтоfl^лл м лу,ъу,,щi ,,вови нуол~втъ,вмму у^вмл,ол т фупуШ щутщулплкв. ѕнтлпоШмfl лмъвмтл,мутъШ тл,,мо, фуоы~вмму,,у м пъл^в пњїє bG, флмflъ б 100%.

тъыфмутъШ мвнуъуРi утму,мли, фу-,ллпупы, уЧытоу,овм нууънлпл мвтъЧлоШмРпл ?флоШнпл олмуи мв Чуовв 7 м. т уЧви т,уЧумуи мв,,лви млнн мв млкв -10 нно/пуоШ. §нлв ?флоШнл мв уокмР тоыклъШ твШвбмРп фвфflътъ,лвп оfl тнмлыв,,у ффъ, фу нимви пвв, ну,, мiуflътfl , тввлмв 5'-ї§љ, нн , тоы~в bTbG [19, 20]. № витъ,лъвоШму, , ъу~нi пнтлпып щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл ,твi фflъл пъл^ бол~вътfl мв Чуовв ~вп , 2 б (лт. 2). љмну кв ънлв мвбм~лъвоШмРв ,ъул~мРв тъынъыР фл,уflъ н пъл~втнупы тмлквмл ыу,мfl ъмтоfl^лл фл Чуовв ,Ртунлi нум^вмъ^лfli пњїє. їЧовпРи щщвнъ пуквъ ЧРъШ уЧflтмвм ъвп, ~ъу лбЧРъун пњїє фл,улъ н т,flбР,мл мвнув,,у нупфумвмъ олбъ, мвуЧiулпу,,у оfl лмл^л^лл ъмтоfl^лл, фуъвЧмутъШ , нуъууп мв,волн лол уътыътъ,ывъ ы bG л Td1bG, му бм~лъвоШм ы TbG, bTbG л Td2bG. љ~в,лму, ~ъу ъу уоквм ЧРъШ нупфумвмъ (тнувв ,тв,,у, Чвоун) т пњїє-т,flбР,лпл т,уитъ,пл, фл~вп оfl ы~тълfl , лмл^л^лл ум уоквм ,блпувитъ,у,ъШ т пњїє , уЧотъл 5'-ї§љ, му фл лбЧРънв њїє т,flбР,млв тъму,лътfl мвтфв^лщл~мРп. јл ъуп олЧу мвтфв^лщл~втнув т,flбР,млв т њїє фл,улъ н в,,у лмнъл,^лл, олЧу пР лпввп воу т Чуовв ~вп умлп нупфумвмъуп, л , ытоу,лfli лбЧРън пњїє фултiулъ лi тфввовмлв ("тътнл,млв") фу бмРп пъл^п, , вбыоШъъв ~в,,у ~лтоу пъл^, м нуъуРi уму,впвмму унбР,ътfl ,тв мвуЧiулпРв нупфумвмъР, вбну ыпвмШ?вътfl. њбол~мfl фуъвЧмутъШ , ъуп мвлб,втъмуп нупфумвмъв ы бол~мРi пњїє пуквъ уЧflт-

мflъШтfl ,уflну. зу-фв,Рi, мв лтно~вму, ~ъу , лмл^л^лл ъмтоfl^лл пњїє TbG, bTbG л Td2bG ы~тъ,ывъ мвнли тфв^лщл~втнли пњїє-т,flбР,ли Чвоун. љмну, ы~лъР,fl мвбм~лъвоШмутъШ бол~ли пвкы ълпл пњїє л пњїє фв,уи ,,ыффР (bG л Td1bG), ъу поу,вуflъму. свитъ,лъвоШму, т,мвмлв Чвону,Рi нупфумвмъу, пњїј ълi пњїє т фупуШ ќў-т?л,нл л щщлммуи iупъу,,щлл Чвону, м њїє-твщубв фунбоу фуомы лi лвмъл~мутъШ (ммРв мв фл,ввмР). зъуув уЧflтмвмлв бно~вътfl , ъуп, ~ъу мол~лв ,ъул~мРi тъынъы , 5'-ї§љ фу,Р?въ мвуЧiулпутъШ , умуп лол мвтнуоШнлi нмумл~втнлi щнъуi лмл^л^лл, нуол~втъ,у нуъуРi , олбъв у,,мл~вму. їлЧуовв ,вуflъмРв нмлъР м ъы уоШ - пњїє-т,flбР,лв щнъуР eIF4F л eIF4B, ънкв щнъу eIF2, ы нуъуу,,у ъу т,уитъ,у млЧуовв ,Рквму. еРоу лмъввтму фу,влъШ ,олflмлв ,,о,му,,у Чвон пњїј, 50, футнуоШны, ту,,отму [21, 22], ъуъ Чвоун, мвтфв^лщл~втнл т,flбР,flтШ т тiущутщъмРп утъу,уп пњїє, фвфflътъ,ывъ мвтфв^лщл~втнупы т,flбР,мл щнъуу, лмл^л^лл л, ънлп уЧбуп, уоквм тфутуЧтъ,у,ъШ тмлквмл щщвнъ ",Рълъу,Р,млfl" лтнупу,,у щнъу. евоун eIF4F ,Рвовм лб новъун HeLa, eIF2, eIF4B л 50 - лб вълныоу^лъу, нуолн. љ~лвммРв у ,,упу,,вмму,,у тутъуflмлfl Чвонл уЧ,оflол , уЧЧуъммРи мыновбуи олбъ вълныоу^лъу, л ъмтолу,ол 25 л 150 пн,,/по пњїє TbG. єуол~втъ,у уЧ,овммРi щнъуу, флпвму , 3-4 б фв,Р?оу нуол~втъ,у ълi кв щнъуу, , олбъв (ту,,отму у^вмнв тувкмлfl щнъуу, , новънв [23-25]). №тфуоШбу,ол пуоflмув тууъму?вмлв Чвоун 50 : пњїє 2.5 : 1 ту,,отму [21]. ?щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл уфввоflол, нн уфлтму ,Р?в. ї лт. 3 фл,ввму уъму?вмлв щщвнъл,мутъл ъмтоfl^лл фл ЧуоШ?ви нум^вмъ^лл пњїє н щщвнъл,мутъл фл пвмШ?ви нум^вмъ^лл. злму, ~ъу лб ,твi фу,ввммРi щнъуу, лмл^л^лл ъуоШну eIF2 тфутуЧвм ы,вол~л,ъШ ммув тууъму?вмлв (ъ.в. мл,волу,ъШ тмлквмлв ыу,мfl ъмтоfl^лл фл ы,вол~вмлл нум^вмъ^лл пњїє). евоун 50, нн л уклоутШ, унбР,о фуоуклъвоШмРи щщвнъ, умну Чуовв тоЧРи, ~вп eIF2. їу щнъуР eIF4F л eIF4B, iуъfl л тълпыолу,ол ъмтоfl^л пњїє TbG фл вв нум^вмъ^лл 25 пн,,/по, мв уЧоол ънуи тфутуЧмутъШ фл Чуовв ,Ртунлi нум^вмъ^лfli пњїє л кв мвпму,,у лм,,лЧлу,ол ъмтоfl^л (ммРв мв фвтъ,овмР), ~ъу тмлкоу тууъму?вмлв щщвнъл,мутъви ъмтоfl^лл фл ЧуоШ?ви л пвмШ?ви нум^вмъ^лfli пњїє (лт. 3). з тоы~в 25 л 75 пн,,/по пњїє фуоуклъвоШмРи щщвнъ eIF2 вв Чуовв ,Рквм фл туiмвмлл уъл^ъвоШму,,у ,олflмлfl ы,,лi щнъуу, (ммРв мв фвтъ,овмР). золflмлв фу,Р?вмму,,у тувкмлfl eIF2 м ъмтоfl^л лбы~лол Чуовв фууЧму. ћ ъуи ^воШ

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003

їцёїд?№§цѓ?ї?ц здњ№дх№№ з§љњ№?їљђ ћ§њќє§ќњ? % 40 35 30 25 20 15 10 5 0
еыщв

499

elF2 (2 пн,,) elF4F (0.05 пн,,) p50(2.5 пуоШ:1пуоШ пњїє) elF4B (0.25 пн,,)

110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

љъмутлъвоШмfl щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл, %

bG §,G 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 єум^вмъ^лfl пњїє, пн,, / по

њлт. 3. золflмлв щнъуу, лмл^л^лл ъмтоfl^лл л Чвон p50 м ыъулм,,лЧлу,млв ъмтоfl^лл ъмтнлфъуп TbG. §мтоfl^л 25 л 150 пн,,/по пњїє фу,улол , олбъв вълныоу^лъу, т уЧ,овмлвп [35S]пвълумлм. ју утл улмъ уъоуквму уъму?вмлв лмъвмтл,мутъл тл,,моу, фуынъу,, фуоы~вммРi фл ъмтоfl^лл 150 л 25 пн,,/по пњїє (%). змлбы ынбмР нуол~втъ, щнъуу,, уЧ,овммРi , тлтъвпы.

њлт. 4. §мтоfl^лfl пњїє bG л TbG , олбъв вълныоу^лъу, нуолн т уЧ,овмлвп щнъу eIF2 (2 пн,,/фуЧы). ћп. фуфлтШ н лт. 2.

бмРв нуол~втъ, пњїє bG л TbG ъмтолу,ол , олбъв вълныоу^лъу, нуолн, , нуъуРи уЧ,оflол у~лвммРи eIF2 (2 пн,, Чвон м 6 пно вн^луммуи тпвтл). єълм ъмтоfl^лл , ълi ытоу,лfli (лт. 4) тлоШму уъол~отШ уъ нълмР , лтiумуп олбъв (лт. 2): щщвнъл,мутъШ ъмтоfl^лл пњїє TbG ,убтъо ,фоуъШ у нум^вмъ^лл пњїє 70 пн,,/по, л нл,Рв б,лтлпутъл ыу,мfl ъмтоfl^лл уъ нум^вмъ^лл пњїє оfl bG л TbG лпвол улмну,Ри ,л (iуъfl фу Чтуоъмуи ,вол~лмв TbG, нн л фвкв, ъмтолу,отШ фу~ъл , 2 б iыкв). §нлп уЧбуп, мп ыоутШ фунбъШ, ~ъу мвутъъун лпвмму eIF2 уъ,вътъ,вм б вбнув тмлквмлв ыу,мfl ъмтоfl^лл фл ы,вол~вмлл нум^вмъ^лл пњїє TbG. ћнувв ,тв,,у, ъу тф,вол,у л оfl ы,,лi пъл^ ту тоЧРпл ,ъул~мРпл тъынъыпл , 5'-ї§љ. јуоы~вммРв ммРв ынбР,ъ м ъу, ~ъу ы пњїє т уму^вфу~в~мРп олвуп ъвЧу,млfl н нум^вмъ^лл eIF2 фумлквмР. ?ъуЧР фуоы~лъШ фflпРв унбъвоШтъ, ъу,,у, 48S лмл^лъумРв нупфовнтР внумтъылу,ол лб у~лвммРi нупфумвмъу, м пњїє bG л TbG, ,Шлыfl нум^вмъ^л eIF2. пњїє, 40S тыЧ~тъл^Р лЧутуп, ѕвъ-ъњїє, GMPPNP, ATP л щнъуР лмл^л^лл eIF1, eIF1д, eIF2, eIF3, eIF4д, eIF4з л eIF4F тпв?л,ол (тп. "ќћѓљз№? ?єћјцњ№ѕцї§д") л лмныЧлу,ол 5 плм фл 30Рћ. 48S нупфовнтР ,лбыолблу,ол т фупуШ ъуы-флмълм,,: н нулыви ~тъл пњїє уъкл,,ол фипв л фу,улол вн^л уЧъмуи ъмтнлф^лл. њвн^луммы тпвтШ футов вфуъвлмлб^лл ммутлол м твн,вмлыли ,,воШ flуп т фуынъпл твн,вмлылi вн^ли, фу,ввммРi т ъу,,у кв фипв. њлу,ъу,,пп ,,воfl фвтъ,овм м

лт. 5. №мъвмтл,мутъл тл,,моу, ъуы-флмъу, у^вмл,ол т фупуШ щутщулплкв ("Molecular Dynamics Phosphor Imager SI"). ї лт. 5Ч фунбм лмъвмтл,мутъШ ъуы-флмъу, (б 100% флмлпол пнтлпоШмы ,вол~лмы лмъвмтл,мутъл нкуи лб ,ыi пњїє). џуу?у ,лму, ~ъу т ы,вол~вмлвп нуол~втъ, eIF2 , тлтъвпв щщвнъл,мутъШ тЧунл 48S м bG тъвъ мпму,,у ЧРтъвв, ~вп м TbG, фнъл~втнл утъл,,fl т,ув,,у пнтлпоШму,,у бм~вмлfl , флтыътъ,лл 50 пн,,/по eIF2, , ъу ,впfl нн , тоы~в TbG ,Рiу м фоъу пнтлпоШмРi бм~вмли мЧовътfl бм~лъвоШму фубкв - флпвму фл 125 пн,,/по eIF2. §нлп уЧбуп, мп ыоутШ умубм~му фунбъШ, ~ъу фу фуъвЧмутъл , eIF2 ,в пњїє бол~ътfl фу~ъл , 2 б, ~ъу, тнувв ,тв,,у, уЧытоу,овму тувкмлвп , 5'-ї§љ TbG мвбм~лъвоШмРi ,ъул~мРi тъынъы л уътыътъ,лвп ънлi тъынъы , bG. №мъввтму, ~ъу фл фв,Р?вмлл уфълпоШму,,у нуол~втъ, eIF2 мЧовътfl мвнуъуув лм,,лЧлу,млв уЧбу,млfl 48S м пњїє bG (лт. 5Ч). ју-,ллпупы, ъу т,flбму т ъвп, ~ъу eIF2, фл в,,у фу,Р?вммуп тувкмлл, пв?въ футнв 40S тыЧ~тъл^Р л/лол щнъуу, ,,ыффР eIF4, ытфв?му нумнылыfl т млпл б т,flбР,млв т мвтъынъылу,ммуи 5'-ї§љ. ї пњїє TbG фл ъвi кв нум^вмъ^лfli eIF2 ъу,,у мв фултiулъ, iуъfl оШмви?вв ы,вол~вмлв нум^вмъ^лл eIF2 (у 500 пн,,/по) фл,улъ н мвбм~лъвоШмупы лм,,лЧлу,мл тЧунл (ммРв мв фл,ввмР). јвтъ,овммРв мпл вбыоШъъР фуб,уоflъ ,,у,улъШ у му,уп пвiмлбпв в,,ыоfl^лл ъмтоfl^лл ынлуъл~втнлi пњїє. єн лб,втъму, нуол~втъ,у нъл,му,,у eIF2 , новънв пуквъ тлоШму пвмflъШтfl. џуу?у лбы~вмР пвiмлбпР в,,ыоfl^лл
9*

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003

500

сѕ№§њ№цз л . TbG bG AC GT 0 14 28 56 112 225 14 28 56 112 225 eIF2, пн,,/по Ч љъмутлъвоШмfl щщвнъл,мутъШ тЧунл 48S, % 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 єум^вмъ^лfl eIF2, пн,,/по bG TbG

њлт. 5. њвнумтъын^лfl 48S лмл^лъумРi нупфовнту, лб у~лвммРi нупфумвмъу, м пњїє bG л TbG фл бмРi нум^вмъ^лfli eIF2, ,Рfl,оflвпfl т фупуШ ъуы-флмъ. - њлу,ъу,,щ ,,воfl т ъуы-флмъпл нупфовнту,. Ч - њвбыоШъъР уЧт~въ лмъвмтл,мутъви ъуы-флмъу, м щутщулплквв (б 100% флмлпол пнтлпоШмы лмъвмтл,мутъШ оfl нкуи лб ,ыi пъл^).

нъл,мутъл eIF2 фыъвп щутщулолу,млfl тыЧвлмл^Р фл ,лытмРi лмщвн^лfli, фуфъубв, плмунлтоуъмуп ,,уоумлл, мвутъънв ,,вп, м-

нуфовмлл , новънв мвф,лоШму т,вмыъРi Чвону, л ы,,лi тъвтту,Рi тлъы^лfli (тп., мфлпв, уЧбу [26]). зубмлнли , ълi ытоу,лfli

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003

їцёїд?№§цѓ?ї?ц здњ№дх№№ з§љњ№?їљђ ћ§њќє§ќњ?

501

вщл^лъ нъл,му,,у eIF2 фл,улъ н лщщввм^л^лл ыу,мfl ъмтоfl^лл бол~мРi пъл^: пњїє т фу,Р?вммРпл ъвЧу,млflпл н щнъуы фнъл~втнл фввтъъ ъмтолу,ъШтfl, л фвлпывтъ,у фуоы~ъ пњїє, тфутуЧмРв лмл^ллу,ъШ фл млбнлi нум^вмъ^лfli ъуиму,,у нупфовнт. њбол~мfl фуъвЧмутъШ , eIF2 ы бмРi пњїє ЧРо лб,втъм л мвв [27]. су уънРълfl нвф-т,flбР,лi щнъуу, ~въ,въуи ,,ыффР ъу т,уитъ,у пњїє кв т~лъоутШ уфввоflлп фл нумнывм^лл пвкы пъл^пл [28]. љмну ъл бол~лfl уЧflтмflолтШ тфв^лщл~втнлп тутъ,уп 5'-ї§љ пњїє н eIF2, л щщвнъл,мутъШ лмл^л^лл ъмтоfl^лл тъ,лотШ , фflпы б,лтлпутъШ уъ щщвнъл,мутъл т,flбР,млfl пњїє т eIF2. ћ ы,,уи тъуумР, фунбму, ~ъу т,flбР,млв eIF2 т пњїє фл,улъ н фуъвв лп ъњїє-т,flбР,ви нъл,мутъл л мв,убпукмутъл уЧбу,млfl ъуиму,,у нупфовнт [29]. ї?л вбыоШъъР оы~?в ту,,отыътfl т ълпл ммРпл. свитъ,лъвоШму, вбнув ыпвмШ?вмлв щщвнъл,мутъл ъмтоfl^лл пњїє TbG л ви фууЧмРi пъл^ фув ,тв,,у уЧflтмлъШ лпвмму лмнъл,^лви пуовныо eIF2, т,flб,?лiтfl т лбЧРънуп пњїє. з пувоfli, фвоуквммРi мвв [27, 30], фвфуо,,вътfl, ~ъу т,flб,?литfl т пњїє eIF2 ,тв-ънл уЧовъ нъл,мутъШ, втол мiулътfl "м т,увп пвтъв" (ъ.в. , уЧотъл олв лол AUG-нуум). еуовв ъу,,у, ъу т,flбР,млв мвуЧiулпу оfl лмл^л^лл, мв б,лтлъ уъ т,flбР,млfl пњїє т поуи тыЧвлмл^ви лЧутупР л кв фв,flвъ в,,у. ћ,flбР,млв кв т нулыви ~тъШ витъ,лъвоШму лмнъл,лывъ eIF2. ћ ълi фубл^ли м?л ммРв уЧ лм,,лЧлу,млл ъмтоfl^лл пњїє ту тъынъылу,ммРпл 5'-ї§љ тову,оу ЧР уЧflтмлъШ фумлквммРп тутъ,уп ънлi олву, (фу т,мвмл т уму^вфу~в~мРпл) н eIF2: м ънлi пњїє eIF2 т,flбР,вътfl фвлпывтъ,вмму т нулыви ~тъШ л ыъ~л,въ нъл,мутъШ, , ъу ,впfl нн м пъл^i т мвтъынъылу,ммРпл 5'-ї§љ щнъу т ЧуоШ?ви ,вуflъмутъШ тлътfl "м т,ув пвтъу", л ы,вол~вмлв нум^вмъ^лл пњїє тнбР,вътfl , пвмШ?ви тъвфвмл. јвфу~ъвмлfl eIF2 , т,flбР,млл њїє бол~муи тъынъыР лбы~вмР фоуiу. ћууЧоутШ [31], ~ъу н мвнуъуРп пњїє тутъ,у щнъу кв пвмШ?в, ~вп н ,ыi^вфу~в~мРп њїє, умну м утму,млл ълi тнымРi ммРi в, ол пукму тнбъШ, fl,оflвътfl ол фл~лмуи бол~ли , ъмтоfl^лл пъл^ т уму^вфу~в~мРпл л тъынъылу,ммРпл олвпл бмув тутъ,у н eIF2. єупв ъу,,у, ънfl ,,лфуъвб фоуiу ту,,отывътfl т уЧмыквммРп мпл тмлквмлвп ыу,мfl уЧбу,млfl 48S , у~лвммуи тлтъвпв ъмтоfl^лл м пњїє bG фл фу,Р?вммуи нум^вмъ^лл eIF2 (лт. 5Ч). зпвтъу мвв пР фво,,вп товыы пувоШ. ћ,flбР,млв ъуиму,,у нупфовнт eIF2 Ч ѕвъъњїє Ч GTP т 40S тыЧ~тъл^ви лЧутупР пуквъ фултiулъШ нн у вв футнл м пњїє, ън л фу-

тов, фл~вп фл мвутъънв eIF2 уЧР~му лпввъ пвтъу ,ъуfl тлъы^лfl [3]. јл ъуп eIF2 тъЧлолблывъ ,блпувитъ,лв 40S т пњїє Чо,,уfl нумънъы т уЧулпл нупфумвмъпл. пњїє т мвтъынъылу,ммРп олвуп уЧбыъ т лЧутупмуи тыЧ~тъл^ви утъъу~му фу~мРи нупфовнт кв , уътыътъ,лв ъуиму,,у нупфовнт, , ъу ,впfl нн оЧРв ,ъул~мРв тъынъыР , 5'-ї§љ тлоШму утоЧоflъ ,блпувитъ,лв 40S т пњїє [5]. №мРпл тоу,пл, фл лмл^л^лл м пъл^i фв,у,,у ълф eIF2 ,Рфуомflвъ ъуоШну умы щымн^л - утъ,ны ѕвъ-ъњїє н 40S тыЧ~тъл^в, тъЧлоШму тту^ллу,ммуи т пњїє л "уклви" вв флiу. љ~в,лму, ~ъу ,впfl клбмл ъну,,у нупфовнт утъъу~му ,волну оfl ъу,,у, ~ъуЧР т,flбР,млв ъуиму,,у нупфовнт фулбу?оу кв фл фумлквммРi нум^вмъ^лfli eIF2 , тлтъвпв. ѕъл^Р кв ту тъынъылу,ммРпл олвпл лтфуоШбыъ eIF2 мв ъуоШну нн твтъ,у утъ,нл ѕвъ-ъњїє, му л нн щнъу, тъЧлолблыли ,блпувитъ,лв 40S т пњїє. з в,,у уътыътъ,лв ъуъ нупфовнт мвтъЧловм л ЧРтъу бы?вътfl, "мв ук,?лтШ" флiу ѕвъ-ъњїє. јл ъуп ,вуflъмутъШ ъу,,у, ~ъу 40S унквътfl м AUG-нуумв, фflпу б,лтлъ уъ нум^вмъ^лл eIF2, л фл млбнлi вв бм~вмлfli тнуутъШ лмл^л^лл м ънлi пъл^i фумлквм. зфуомв ,убпукму, ~ъу ъуимуи нупфовнт eIF2 Ч ѕвъ-ъњїє Ч GTP ,квм вв л нн фупумлн мвфу^вттл,муи iволнбР eIF4д, футнуоШны в,,у т,flбР,млв т пњїє мв въ тфовъвммРп ыфовнтп "тiоуфР,ъШтfl", ~ъу вв ЧуоШ?в тъЧлолблывъ нумънъ пњїє т 40S тыЧ~тъл^ви. ?ъ уоШ уЧР~му уъ,улътfl щнъуы eIF4з [32], умну мвоШбfl лтно~лъШ, ~ъу л eIF2 ы~тъ,ывъ , ъуп фу^вттв. §нлп уЧбуп, мв,Ртунfl тнуутъШ лмл^л^лл м пњїє ту тъынъылу,ммРпл 5'-ї§љ уЧflтмflвътfl мв ъуоШну л, пуквъ ЧРъШ, мв тъуоШну мвуЧiулпутъШ ,впвммРi бъъ м тфовъмлв ,ъул~мРi тъынъы, тнуоШну фу,Р?вммРпл ъвЧу,млflпл н тувкмл eIF2, тъЧлолблывпы ,блпувитъ,лв поуи лЧутупмуи тыЧ~тъл^Р т пњїє. з пнi ммуи ЧуъР мв фомлу,оутШ лбы~вмлв нлмвълнл уЧбу,млfl 48S нупфовнту, м пњїє т бол~муи тъынъыуи фл бол~мРi нум^вмъ^лfli eIF2, му , оШмви?вп уму уЧflбъвоШму уокму ЧРъШ фу,ввму. д,ъуР ,Ркъ Чо,,умутъШ ?.ц. сымв,тнупы б фупуШ , ,Рвовмлл щнъуу, лмл^л^лл, ѓ.ј. љ,~лммлну,ы б фвутъ,овмлв фвфъ Чвон 50 л д.з. јлтв,ы б уЧтыквмлв вбыоШъъу,. њЧуъ ,Рфуомвм фл фувкнв њуттлитну,,у щум щымпвмъоШмРi лттову,мли (96-0455009 л 01-04-06503 "ѕдћ") л ўввоШмуи ^вов,уи фу,,ппР "№мъв,,^лfl" (2000-1.5-88).

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003

502

сѕ№§њ№цз л .

ћј№ћљє ѓ№§цњд§ќњ?
1. Dever T.E. 2002. Gene-specific regulation by general translation factors. Cell. 108, 545-556. 2. Pestova T.V., Kolupaeva V.G., Lomakin I.B., Pilipenko E.V., Shatsky I.N., Agol V.I., Hellen C.U. 2001. Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 7029-7036. 3. Dasso M.C., Milburn S.C., Hershey J.W., Jackson R.J. 1990. Selection of the 5'-proximal translation initiation site is influenced by mRNA and eIF-2 concentrations. Eur. J. Biochem. 187, 361-371. 4. Hinnebusch A.G. 1993. Gene-specific translational control of the yeast GCN4 gene by phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2. Mol. Microbiol. 10, 215-223. 5. Seal S.N., Schmidt A., Marcus A. 1989. Ribosome binding to inosine-substituted mRNAs in the absence of ATP and mRNA factors. J. Biol. Chem. 264, 7363-7368. 6. Barrieux A., Rosenfeld M.G. 1977. Characterization of GTP-dependent Met-tRNAf binding protein. J. Biol. Chem. 252, 3843-3847. 7. Abramson R.D., Dever T.E., Lawson T.G., Ray B.K., Thach R.E., Merrick W.C. 1987. The ATP-dependent interaction of eukaryotic initiation factors with mRNA. J. Biol. Chem. 262, 3826-3832. 8. Hughes D.L., Dever T.E., Merrick W.C. 1993. Further biochemical characterization of rabbit reticulocyte eIF-4B. Arch. Biochem. Biophys. 301, 311-319. 9. Gozes I., Schmitt H., Littauer U.Z. 1975. Translation in vitro of rat brain messenger RNA coding for tubulin and actin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72, 701-705. 10. Wettenhall R.E., Slobbe A. 1976. Inhibitory action of different RNA fractions on the translation of globin mRNA in vitro. Biochim. Biophys. Acta. 432, 323-328. 11. Minich W.B., Korneyeva N.L., Ovchinnikov L.P. 1989. Translational active mRNPs from rabbit reticulocytes are qualitatively different from free mRNA in their translatability in cell-free system. FEBS Lett. 257, 257-259. 12. Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3d Ed. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001. 13. Gielen J., Aviv H., Leder P. 1974. Characteristics of rabbit globin mRNA purification by oligo(dT) cellulose chromatography. Arch. Biochem. Biophys. 163, 146-154. 14. ?ътнли №.ї. 2001. њвнумтъын^лfl лмл^ллылi нупфовнту, in vitro оfl лттову,млfl пуовныоflмРi пвiмлбпу, лмл^л^лл ъмтоfl^лл ы повнуфлълi. ѕуовныоfl. Члуоу,,лfl. 35, 628-637. 15. Pestova T.V., Hellen C.U. 2001. Preparation and activity of synthetic unmodified mammalian tRNAi(Met) in initiation of translation in vitro. RNA. 7, 1496-1505. 16. Merrick W.C. 1979. Purification of protein synthesis initiation factors from rabbit reticulocytes. Methods Enzymol. 60, 101-108. 17. Grifo J.A., Tahara S.M., Morgan M.A., Shatkin A.J., Merrick W.C. 1983. New initiation factor activity required for globin mRNA translation. J. Biol. Chem. 258, 5804-5810. 18. Zhang Y., Dolph P.J., Schneider R.J. 1989. Secondary structure analysis of adenovirus tripartite leader. J. Biol. Chem. 264, 10679-10684.

19. Kozak M. 1989. Circumstances and mechanisms of inhibition of translation by secondary structure in eucaryotic mRNAs. Mol. Cell Biol. 9, 5134-5142. 20. Vega Laso M.R., Zhu D., Sagliocco F., Brown A.J., Tuite M.F., McCarthy J.E. 1993. Inhibition of translational initiation in the yeast Saccharomyces cerevisiae as a function of the stability and position of hairpin structures in the mRNA leader. J. Biol. Chem. 268, 6453-6462. 21. Minich W.B., Ovchinnikov L.P. 1992. Role of cytoplasmic mRNP proteins in translation. Biochimie. 74, 477-483. 22. Pisarev A.V., Skabkin M.A., Thomas A.A., Merrick W.C., Ovchinnikov L.P., Shatsky I.N. 2002. Positive and negative effects of the major mammalian messenger ribonucleoprotein p50 on binding of 40S ribosomal subunits to the initiation codon of beta-globin mRNA. J. Biol. Chem. 277, 15445-15451. 23. Safer B., Kemper W., Jagus R. 1979. The use of [14C]eukaryotic initiation factor 2 to measure the endogenous pool size of eukaryotic initiation factor 2 in rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 254, 8091-8094. 24. Duncan R., Hershey J.W. 1983. Identification and quantitation of levels of protein synthesis initiation factors in crude HeLa cell lysates by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 258, 7228-7235. 25. Rau M., Ohlmann T., Morley S.J., Pain V.M. 1996. A reevaluation of the cap-binding protein, eIF4E, as a ratelimiting factor for initiation of translation in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 8983-8990. 26. Clemens M.J. 2001. Initiation factor eIF2 alpha phosphorylation in stress responses and apoptosis. Progress Mol. Subcell. Biol. 27, 57-89. 27. Rosen H., Di Segni G., Kaempfer R. 1982. Translational control by messenger RNA competition for eukaryotic initiation factor 2. J. Biol. Chem. 257, 946-952. 28. Di Segni G., Rosen H., Kaempfer R. 1979. Competition between alpha- and beta-globin messenger ribonucleic acids for eukaryotic initiation factor 2. Biochemistry. 18, 2847-2854. 29. Barrieux A., Rosenfeld M.G. 1978. mRNA-induced dissociation of initiation factor 2. J. Biol. Chem. 253, 6311- 6314. 30. Thomas A.A., Scheper G.C., Voorma H.O. 1992. Hypothesis: is eukaryotic initiation factor 2 the scanning factor? New Biol. 4, 404-407. 31. Rosen H., Knoller S., Kaempfer R. 1981. Messenger ribonucleic acid specificity in the inhibition of eukaryotic translation by double-stranded ribonucleic acid. Biochemistry. 20, 3011-3020. 32. Jaramillo M., Dever T.E., Merrick W.C., Sonenberg N. 1991. RNA unwinding in translation: assembly of helicase complex intermediates comprising eukaryotic initiation factors eIF-4F and eIF-4B. Mol. Cell Biol. 11, 5992-5997.

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003

їцёїд?№§цѓ?ї?ц здњ№дх№№ з§љњ№?їљђ ћ§њќє§ќњ?

503

Minor Secondary-Structure Variation in the 5'-Untranslated Region of the b-Globin mRNA Changes the Concentration Requirements for eIF2
S. E. Dmitriev, I. M. Terenin, M. P. Rubtsova, and I. N. Shatsky
Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Moscow State University, Moscow, 119899 Russia; E-mail: shatsky@libro.genebee.msu.su Nucleotide sequence changes increasing the number of paired bases without producing stable secondary structure elements in the 5'-untranslated region (5'-UTR) of the -globin mRNA had a slight effect on its translation in rabbit reticulocyte lysate at its low concentration and dramatically decreased translation efficiency at a high concentration. The removal of paired regions restored translation. Addition of purified eIF2 to the lysate resulted in equal translation efficiencies of templates differing in structure of 5'-UTR. A similar effect was observed for p50, a major mRNP protein. Other mRNA-binding initiation factors, eIF4F and eIF3B, had no effect on the dependence of translation efficiency on mRNA concentration. Analysis of the assembly of the 48S initiation complex from its purified components showed that less eIF2 is required for translation initiation on the -globin mRNA than on its derivative containing minor secondary structure elements in 5'-UTR. According to a model proposed, eIF2 not only delivers Met-tRNA, but it also stabilizes the complex of the 40S ribosome subunit with 5'-UTR, which is of particular importance for translation initiation on templates with structured 5'-UTR.

ѕљѓцєќѓ?њїд? е№љѓљй№? ъуп 37 < 3 2003