Е. Г. Бочкарев, Ю. В. Сергеев, В. М. Копылов, Д. В. Рюмин

Институт аллергологии и клинической иммунологии, НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Москва

В начало...

Генодиагностика трихомониаза

С начала 90-х годов в лабораторную клиническую практику стали внедряться генодиагностические технологии определения специфических областей ДНК-мишени генома вирусов, бактерий и клеток высших организмов. Сначала это была ДНК-гибридизационная технология. Например, в коммерческой тест-системе Affirm VP (Micro Prob Corp, Bothwell, Wash.) используются синтетические зонды для выявления как Gardnerella vaginalis, так и T.vaginalis из одного вагинального соскоба. Данная методика лучше, чем метод влажной камеры. Тем не менее, встречались ложноотрицательные результаты при ее сравнении с культуральным методом (80% чувствительности относительно положительных образцов в культуре).

Одна из гибридизационных методик - "дот-блот" гибридизация, в которой использовался фрагмент ДНК T.vaginalis в качестве зонда, позволяющий определять T.vaginalis в вагинальном экссудате. Однако нестабильность зонда, выполнение специфических технических приемов, особенно использование радиоактивной метки являлись большими недостатками этой методики. После того как радиоактивно меченный зонд заменили на флюоресцентномеченный ДНК-зонд, эта методика сразу нашла свое применение при выявлении бессимптомного носительства T.vaginalis.

Новая технология генодиагностики - полимеразная цепная реакция (ПЦР) в последнее время занимает одно из ведущих мест при лабораторной дифференцировке трихомониаза. Одним из самых ответственных этапов является забор материала, осуществляемый в лечебном учреждении. Материал (сквамозный эпителий) рекомендуется брать одноразовой специальной щеточкой cervix-brush (voba-brush) или тщательно обработанной (отмытой и стерильной) ложкой Фолькмана из уретры мужчин/ женщин или цервикального канала женщин. У женщин рекомендуется брать материал также из заднего свода влагалища. При взятии материала из цервикального канала его предварительно очищают ватным тампоном. Щеточка вводится в канал на глубину 1,5-2 см, вращается 15 секунд, ополаскивается в 100 мкл физиологического раствора, находящегося в пробирке (типа Эппендорф) для транспортировки биоматериала и выбрасывается. Ни в коем случае нельзя оставлять щеточку в пробирке - это сильно затрудняет анализ в дальнейшем. Пробирку с материалом хранят при +4-10^оС в холодильнике в течение трех дней или при - 20^оС в течение двух недель. Доставку биоматериала на ПЦР-анализ желательно осуществлять в термоконтейнере или термосе со льдом.

Lin P.R. et al. [26] предложили одностадийную нестед-ПЦР методику определения ДНК T.vaginalis из отделяемого вагины. Они определяли последовательность мишеней в семействе повторов длиной 650 пар оснований. Перекрестной реакции не отмечалось с ДНК человека и таких патогенов как Pentatrichomonas hominis и Giargia lamblia. Диагностический процесс занимал 6 часов. Из 165 клинических образцов, исследованных с помощью ПЦР, культуральным методом и микроскопией влажного препарата, 16 оказались положительными на наличие T.vaginalis по данным ПЦР и росту в культуре. Микроскопия выявила только 9 положительных образцов из 16. Ни один из ПЦР-отрицательных образцов не был положительным в других методиках. Интересно, что впоследствии эти авторы дополнили свою методику калориметрической детекцией специфических ампликонов вместо электрофореза, что помогло при исследовании образцов от 113 пациентов с отсутствием клинических симптомов выявить 9 случаев инфицирования T.vaginalis, не выявлявшихся другими методиками (табл.1).

Таблица 1. Данные сравнительного исследования 165 образцов вагинального секрета методами микроскопии, культурального посева и ПЦР на наличие T.vaginalis
Метод исследования	Количество выявленных носителей T.vaginalis	Количество невыявленных носителей T.vaginalis
Микроскопия	9	156
Культуральный	16	149
ПЦР	16	149

Madico S.R. et al. [28] разработали ПЦР - тест, определяющий консервативную часть гена бета-тубулина влагалищной трихомонады. Эта последовательность мишеней амплифицировалась у всех 15 лабораторных штаммов T.vaginalis и не амплифицировалась у Trichomonas tenax, Trichomonas gallinea, Chlamуdia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Giargia lamblia, Chilomastix sulcatus, Dientamoeba fragilitis, Entamoeba histolytica. Из 350 мазков, взятых от женщин с вагинитом, с помощью культурального метода (среда Inpouch TV) определили 23 случая трихомониаза. Из них 22 были подтверждены методом ПЦР и только 12 случаев подтвердились при микроскопии влажного препарата. 17 случаев было ПЦР-положительных и культурально-отрицательных, среди них в дальнейшем 10 случаев подтвердилось при обследовании других областей ДНК T.vaginalis методом ПЦР. Таким образом, было признано, что данный ПЦР-тест имеет чувствительность 97% и специфичность 98% в сравнении с 70% чувствительности культурального метода и 36% метода микроскопии (табл.2).

Таблица 2. Данные сравнительного исследования 350 образцов вагинального секрета методами микроскопии, культурального посева и ПЦР на наличие T.vaginalis
Метод исследования	Количество выявленных носителей T.vaginalis	Количество невыявленных носителей T.vaginalis
Микроскопия	12	338
Культуральный	23	327
ПЦР (праймеры к консервативной части гена бета-тубулина и других консервативных последовательностей генома T.vaginalis)	32	318

Анализ использования ПЦР-методики идентификации ДНК влагалищной трихомонады с праймерами, определяющими повторяющуюся последовательность TV-E650, в сравнении с клиническими данными и другими лабораторными методами (микроскопия влажного препарата, микроскопия мазка, приготовленного по методу Папаниколау, культуральный) показал, что предложенный метод в 100% случаев чувствителен и специфичен, так как не давал перекрестной реакции с другими простейшими и Candida albicans. Использованная методика ПЦР в два раза чаще выявляла трихомонаду, чем другие сравниваемые лабораторные методики [28].

Tabrezi S.N. et al. [34] проанализировали сравнительную выявляемость Neisseria gonorrhoeae, Chlamуdia trachomatis и T.vaginalis при взятии образца мочи и с тампона методом ПЦР. Они обнаружили, что ПЦР в случае исследования тампона одинаково часто выявляет хламидии, но в два раза чаще гонококки и трихомонады. Причем в дальнейших исследованиях они подтвердили эти данные, показав, что наиболее распространенная клиническая методика выявления трихомонад - микроскопия препарата, приготовленного по методу Папаниколау и принятая у них в клинической лаборатории, давала 59% положительных ответов относительно ПЦР.

В настоящее время в России отдельные медицинские центры начинают применять в лабораторной практике ПЦР-технологию при диагностике мочеполового трихомониаза.

В клинико-диагностической лаборатории НИИ физико-химической медицины МЗ РФ трихомониаз был выявлен методом ПЦР в 1,7% случаев лабораторных исследований (637 исследований в 1999 г).

Cухова Л.П. и соавт. [16] исследовали уретральное отделяемое 68 мужчин - половых партнеров женщин, больных трихомонадной инфекцией методами ПЦР, микроскопическим и культурально-микроскопическим (табл.3). Результаты исследования микроскопическим методом не совпали с результатами ПЦР в 25 (36%) случаях - ложноотрицательные ответы, культурально-микроскопического в 15 (22%) случаях - ложноположительные ответы. Данное соотношение разрешающих способностей ПЦР/микроскопия как 2,5-2:1 соответствует данным мировой литературы и демонстрирует преимущество ПЦР при диагностике трихомониаза по сравнению с традиционным обследованием. По мнению авторов, ПЦР-технология как наиболее чувствительная является методом выбора при диагностике хронических и асимптомных форм заболевания.

Таблица 3. Данные сравнительного исследования 68 образцов уретрального отделяемого методами микроскопии, культурально-микроскопическим ("Трихомона Скрин" Биосервис)и ПЦР на наличие T.vaginalis
Метод исследования	Количество выявленных носителей T.vaginalis	Количество невыявленных носителей T.vaginalis
Микроскопия	29 (43%)	39 (57%)
Культуральный	39 (57%)	29 (43%)
ПЦР	54 (79%)	14 (21%)

Далее...