С.Г. Ворсанова, Ю.Б. Юров, И.В. Соловьев, И.А. Демидова, В.О. Шаронин, Н.В. Вехова, А.К. Берешева, П. Мале, М. Жиолант, А.Д. Колотий, В.С. Кравец, Л.З. Казанцева, Ж. Ройзес

Молекулярно-цитогенетическая диагностика является современным направлением в клинической цитогенетике, целью которого является разработка и применение новых и высокоэффективных методов анализа хромосомопатий. Представлены результаты молекулярно-цитогенетических исследований в пост- и пренатальной идентификации хромосомных аномалий. Объектом исследования были культивируемые клетки крови детей с умственной отсталостью и врожденными пороками развития (ВПР) (3304 случая) и клетки культуры амниотической жидкости и хориона плода беременных женщин (1971). Молекулярно-цитогенетические методы (FISH-диагностика) использовались в 50 пренатальных и 76 постнатальных случаях диагностики (всего 126), когда классические цитогенетические методы были малоэффективны: пост- и пренатальные трисомии аутосом; анеуплоидии гоносом, включая мозаичные формы; маркерные хромосомы; структурные хромосомные аномалии, в том числе синдром ломкой хромосомы Х. При проведении молекулярно-цитогенетической диагностики использовали протокол быстрой (15-30 мин) FISH и оригинальную коллекцию центромерных, теломерных и сайтспецифичных ДНК-проб (плазмидных, космидных, РАС и УАС клонов). Проведенные исследования показали, что молекулярно-цитогенетический анализ эффективен для идентификации различных хромосомных аномалий в пре- и постнатальной диагностике; FISH-анализ - необходимый, дополнительный к классической цитогенетической диагностике метод для выявления определенных хромосомных аберраций. Молекулярные исследования хромосомопатий имеют как прикладное, так и важное теоретическое значение, поскольку позволяют выделять специфические хромосомные синдромы в обширной группе детей с недифференцированными формами умственной отсталости и врожденными пороками развития.

Ключевые слова: дети, хромосомные аномалии, молекулярно-цитогенетическая диагностика.

Достижения молекулярной цитогенетики связаны в последнее десятилетие с принципиально новыми подходами к диагностике наследственно обусловленной патологии и, прежде всего, хромосомных болезней [1-4]. Это стало возможным в результате разработки и внедрения в клиническую цитогенетику комплекса новых технологий - ДНК-диагностики, гибридизации нуклеиновых кислот in situ и компьютерных систем для анализа хромосом. ДНК-диагностика основана на использовании технологии рекомбинантных молекул ДНК и приготовления специальных ДНК-зондов для выявления и молекулярного анализа генетических дефектов [5]. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH - fluorescence in situ hybridization) включает применение специально подготовленных (флюоресцирующих) ДНК-проб для выявления генетических дефектов на хромосомном уровне и проведения процедуры молекулярно-цитогенетической диагностики с использованием современной флюоресцентной микроскопии. Компьютерные системы для анализа хромосом включают специальные телекамеры для выявления сверхслабых сигналов, полученных при проведении in situ гибридизации, а также компьютерные программы, позволяющие проводить автоматический анализ хромосом и высокоэффективную многоцветную детекцию ДНК-зондов для диагностики хромосомных и генных нарушений на микроскопическом уровне.

Идентификация хромосомной патологии базируется на основе использования различных типов ДНК-зондов, позволяющих маркировать индивидуальные хромосомы или их отдельные участки. ДНК-зонды представляют собой клонированные фрагменты ДНК генома человека, при гибридизации которых с метафазными хромосомами или интерфазными клетками можно определить особенности хромосомного набора и наличие хромосомных нарушений [2]. Наиболее часто в клинической цитогенетике используются хромосомспецифичные центромерные ДНК-зонды, позволяющие эффективно выявлять наиболее частые хромосомные синдромы, такие как синдромы Дауна, Патау, Эдвардса, Клайнфелтера, Тернера и др. Используя молекулярно-цитогенетический метод, можно выявлять и анализировать нормальные и аномальные хромосомы и их число в любых типах клеток человека, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, в том числе и в интерфазе, что особенно важно при проведении пренатальной диагностики [6]. Для успешной диагностики хромосомных синдромов необходимо располагать большой коллекцией ДНК-зондов для выявления наиболее частых и социально значимых хромосомопатий. Специальные исследования, проведенные нами, позволили клонировать и выявить хромосомспецифичные центромерные ДНК-зонды всех хромосом человека и создать оригинальную коллекцию проб, не уступающую по качеству и количеству ДНК-зондам мировой коллекции [3, 7-9]. В последние годы, в дополнение к центромерным зондам, нами также получены новые типы ДНК-зондов для различных хромосом и их отдельных сегментов, представляющих практический интерес для клинической цитогенетики. Новая коллекция включает оптимизированные ДНК-зонды на основе космидных [10] и YAC (yeast artificial chromosome) клонов [11], а также РАС (PI phage artificial chromosome) клонов (всего 600 новых ДНК-зондов). Полученная коллекция новых клонов используется для дальнейших исследований по определению сложных форм хромосомной патологии в молекулярной цитогенетике и многоцветовой FISH для маркирования хромосомных аномалий, включая центромерные и теломерные районы хромосом и их индивидуальные сегменты. Для повышения эффективности молекулярно-цитогенетической диагностики были разработаны также оригинальные методы флюоресцентной гибридизации in situ - <быстрая> FISH (в течение 15-20 мин), специально адаптированная для ускоренной идентификации хромосом и их нарушений в практике клинической цитогенетики [8, 12].

Согласно современным представлениям [13], молекулярно-цитогенетическая диагностика с использованием FISH-метода применяется в различных разделах медицинской генетики:

- для определения численных и структурных хромосомных аномалий в клинической цитогенетике;

- для идентификации маркерных (мини-, дополнительных) хромосом;

- для определения анеуплоидий в неделящихся пренатальных и постнатальных интерфазных клетках;

- для определения различных специфических и неспецифических хромосомных аномалий в онкоцитогенетике;

- для анализа хромосомных аномалий в клинической цитогенетике (изохромосомы, сбалансированные хромосомные аномалии при различных клинических картинах синдрома и т.д.);

- для анализа хромосомных аберраций в генетико-токсикологических исследованиях.

Следует отметить, что многоплановые исследования по молекулярно-цитогенетической диагностике ведутся лишь в небольшом числе клинико-цитогенетических лабораторий мира, что связано с методической сложностью и относительно высокой стоимостью этих исследований. Тем не менее в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ эти исследования были начаты одними из первых в мире и, благодаря оригинальным подходам и методическим разработкам (изобретения, патенты), в настоящее время охватывают практически весь спектр современных диагностических исследований.

Таким образом, молекулярно-цитогенетическая диагностика является современным направлением в клинической цитогенетике. Целью ее является разработка и применение новых высокоэффективных методов анализа хромосомопатий как в пост-, так и в пренатальный период. Молекулярные исследования (5275) были использованы нами в постнатальной и пренатальной идентификации хромосомных аномалий. Объектами исследования были культивируемые клетки крови детей с умственной отсталостью и врожденными пороками развития (3304) или культивируемые клетки амниотической жидкости и хориона плода беременных женщин (1971).

В 65 (3,3%) случаях пренатальных хромосомных исследований были обнаружены хромосомные аномалии, в том числе 46 (70,8%) анеуплоидий: аутосом - 31 (47,7%) и гоносом - 15 (23,1%), а также структурные хромосомные аберрации - 19 (29,2%). В 50 (76,9%) из 65 исследований были использованы молекулярно-цитогенетические методы с целью подтверждения анеуплоидий аутосом и гоносом - 37 (56,9%) случаев, уточнения степени мозаицизма - 6 (9,2%), идентификации маркерных хромосом - 4 (6,2%), анализа транслокаций с точками разрыва в околоцентромерных участках - 3 (4,8%).

Молекулярно-цитогенетическая диагностика использовалась в 76 (23%) из 330 (10%) случаев (всего 3304) постнатальных хромосомных аномалий, обнаруженных (или предполагаемых) классическими цитогенетическими методами [131 (4%) случай структурных хромосомных аномалий, 199 (6%) - численных хромосомных аномалий: 88 (44,2%) - аномалий гоносом, 111 (55,8%) - аутосом]. Одним из основных положений по использованию молекулярно-цитогенетической диагностики при обследовании детей с задержкой умственного развития и врожденными пороками развития является тот факт, что более 20% всех детей, имеющих хромосомные аномалии, нуждаются в проведении молекулярного анализа. Это принципиально новое положение. Подавляющее число этих детей ранее не имели диагноза.

В результате проведенных нами исследований впервые в мире были разработаны показания к применению молекулярно-цитогенетических методов в постнатальной диагностике у детей с недифференцированными формами умственной отсталости и множественными врожденными пороками развития. Эти показания включают:

1) анализ случаев сложного хромосомного мозаицизма с небольшим клоном аномальных клеток;

2) определение происхождения и генетического состава дополнительных маркерных хромосом;

3) идентификация хромосом, вовлеченных в сложные перестройки при участии 3 хромосом и более;

4) уточнение точек разрыва на хромосомах и потерь генетического материала на хромосомном и субхромосомном уровнях в случае сложных хромосомных аномалий (сбалансированные и несбалансированные транслокации, особенно семейные случаи) или теломерных (субтеломерных) хромосомных делеций;

5) идентификация ломкой хромосомы Х при синдроме умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х;

6) изучение и выявление хромосомных вариантов.

Таким образом, разработка методов молекулярно-цитогенетической диагностики дала реальную возможность для идентификации маркерных хромосом и хромосомного мозаицизма в случаях, когда в организме ребенка, помимо нормального, развивается один или несколько клонов аномальных клеток. Среди нозологических форм, сопровождающихся клеточным мозаицизмом, наиболее часто встречаются синдромы аномалий гоносом такие как синдромы Клайнфелтера (кариотип полной формы 47, XXY) и Шерешевского-Тернера (45,Х), дисомии Y (47,ХYY) и трисомии Х (47,ХХХ). Частота полных (немозаичных) форм синдромов составляет в сумме около 4,6 на 1000 новорожденных детей (2,0, 0,4, 1,5 и 0,65 соответственно). Частота мозаичных форм при определении у больного нормальных (кариотипы - 46,XY или 46,ХХ) и аномальных (кариотипы - 47,XXY; 45,X; 47,XYY; 47,XXX) клонов клеток изучена недостаточно, что связано с методическими трудностями в диагностике, особенно при незначительной (до 20%) доле аномального клона клеток [14]. К методическим сложностям относятся такие, как недостаточность числа метафазных клеток для постановки диагноза, а также элиминация аномальной клеточной линии при однократном (иногда и при повторном) цитогенетическом исследовании клеток крови. Все сказанное увеличивает значимость молекулярно-цитогенетической диагностики мозаичных форм хромосомных синдромов. Сложные формы мозаицизма являются показанием для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики.

Далее...