С.Г. Ворсанова, Ю.Б. Юров, И.В. Соловьев, И.А. Демидова, В.О. Шаронин, Н.В. Вехова, А.К. Берешева, П. Мале, М. Жиолант, А.Д. Колотий, В.С. Кравец, Л.З. Казанцева, Ж. Ройзес

В начало...

Проблема происхождения добавочных, или маркерных мини-хромосом и связи их с определенной клинической картиной недостаточно изучена. Эти хромосомы часто сегрегируют в семье и у отдельных ее членов могут вызывать клинические проявления патологии в виде умственной отсталости и врожденных пороков развития, в то время как другие члены семьи фенотипически остаются нормальными. Частота встречаемости маркерных хромосом в популяции сравнима с частотой синдрома Дауна и составляет 1-2 случая на 1000 [15-17], при этом 40% случаев - семейные [17]. Определение происхождения данных хромосом традиционными цитогенетическими методами в таких случаях крайне затруднено. Как правило, эти лишние акроцентрические или метацентрические хромосомы в кариотипе имеют небольшой размер и состоят из материала различных хромосом или их участков с центромерой и околоцентромерным гетерохроматином [18, 19]. Использование ДНК-зондов при гибридизации in situ позволяет определить молекулярный состав добавочных хромосом и их происхождение, а также обосновать тактику проведения пренатальной диагностики в семье при повторных случаях. Так, наши результаты показывают, что обнаружение у плода маркерной хромосомы, аналогичной по молекулярному составу хромосоме фенотипически здоровой матери, дает основание для продления беременности, а выявление маркерной хромосомы, аналогичной по молекулярному составу подобной хромосоме больного сибса, является показанием к прерыванию беременности. При определении происхождения маркерных хромосом необходимо иметь большую коллекцию ДНК-зондов на все хромосомы человека. С целью проведения эффективной диагностики и сокращения применения числа ДНК-зондов для анализа маркерных хромосом нами была разработана оригинальная схема молекулярной диагностики (см. схему), в которой на первых этапах - в <мягких> условиях гибридизации определяют групповое происхождение мини-хромосомы, а на последующих этапах - в <жестких> условиях гибридизации - ее генетический состав и принадлежность. Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о том, что наличие маркерной хромосомы в кариотипе во всех случаях является показанием для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики.

Схема идентификации дополнительных маркерных хромосом

I этап. Классический цитогенетический анализ кариотипа и возможного происхождения маркерной хромосомы (GTG, СВG-методы дифференциального окрашивания). II этап. Гибридизации in situ в <мягких> условиях для групповой оценки происхождения маркерной хромосомы: - ДНК-зонд на группу хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 (а); - ДНК-зонд на группу хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20 (б); - ДНК-зонд на группу хромосом 1, 11, 17, Х (в); - ДНК-зонд на хромосомы 13, 14, 15, 21, 22, Y (г). III этап. <Направленная> гибридизация в <жестких> условиях с хромосомоспецифичными ДНК-зондами определенной группы (а), (б), (в) или (г) для точной идентификации дополнительной маркерной хромосомы. IV этап (дополнительный). Гибридизация с <уникальными> или сайтспецифичными ДНК-зондами, картированными в определенном районе хромосом, для окончательного уточнения генетического состава маркерной хромосомы.

Следующим показанием для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики являются хромосомные нарушения с вовлечением большого числа (до 5) хромосом. Применение хромосомспецифичных ДНК-проб способствует успешной идентификации отдельных хромосом или их участков при сложных перестройках. В подобных случаях показанием к проведению молекулярно-цитогенетической диагностики служит невозможность точной идентификации хромосом классическими методами цитогенетики.

Молекулярно-цитогенетическую диагностику следует применять в целях уточнения точек разрыва на аномальных хромосомах и выявления субхромосомных делеций хромосомного материала. Выявить точки разрывов в участках околоцентромерного гетерохроматина, как правило, трудно из-за отсутствия поперечной исчерченности в этих районах при дифференциальном окрашивании хромосом. Также практически невозможно на хромосомном уровне, даже при использовании высокоразрешающих методов окрашивания, выявить субхромосомные делеции в теломерных или интерстициальных участках хромосом. С применением метода гибридизации in situ при использовании строго специфичных ДНК-зондов для предположительно аберрантного участка хромосомы можно однозначно ответить на вопрос, присутствуют ли определенные типы хромосомной ДНК в аномальной и нормальной (гомологичной) хромосоме. Следовательно, микроскопический анализ результатов гибридизации in situ на качественном или количественном уровне позволяет выявить точки разрывов, микроделеции и микротранслокации хромосомного материала в кариотипе человека. Несомненным показанием к проведению FISH-диагностики является невозможность уточнения точек разрыва, потери или удвоения хромосомного материала традиционными цитогенетическими методами, включая и микроцитогенетические [20].

Ломкие (фрагильные) участки хромосомы Х при диагностике синдрома умственной отсталости, сцепленного с ломкой хромосомой Х, принято оценивать традиционными цитогенетическими методами. Однако трудоемкость данного способа их выявления, связанная с необходимостью применения последовательно рутинного и G-окрашивания хромосом, приводит к потере метафаз, обязательных для учета экспрессии ломкости. Молекулярно-цитогенетический метод, при котором маркируется хромосома Х, позволяет анализировать ее ломкие участки при рутинном окрашивании, что значительно повышает эффективность диагностики данного синдрома. Данные наших исследований показывают, что при учете ломких участков хромосомы Х с помощью молекулярно-цитогенетического метода выявляемость экспрессии ломкости повышается в 2-3 раза. Показанием к проведению этих методов является отсутствие ломкости хромосомы Х (или ее незначительная экспрессия) при типичной клинической картине синдрома. В настоящее время диагностика этого синдрома переходит в основном на молекулярный уровень. Однако применение соответствующих ДНК-зондов и компьютерных программ, при которых появляется возможность усиления сигнала на хромосоме после гибридизации in situ, позволит анализировать мутацию в гене под микроскопом.

Хромосомные варианты или увеличение околоцентромерного гетерохроматина отдельных хромосом (1qh+, 9qh+, 16qh+) довольно часто (до 20%) встречаются при недифференцированных формах умственной отсталости [21]. Кроме того, они выявляются и при синдромах, не связанных с умственной отсталостью. Так, мы обнаружили такие хромосомные варианты при синдроме Картагенера. Применяя молекулярно-цитогенетический анализ, можно на молекулярном уровне оценить вариабельность околоцентромерных гетерохроматиновых участков, т.е. соответствие цитологического полиморфизма молекулярному (большее число копий ДНК отражает больший по размеру С-сегмент), и определить, за счет каких копий ДНК идет увеличение сегмента (альфоидная или <классическая> сателлитная ДНК). Данные проведенного исследования показывают, что увеличение околоцентромерного гетерохроматина идет за счет увеличения числа копий <классической> сателлитной ДНК, и два типа повторяющихся последовательностей ДНК (альфоидная и <классическая> сателлитная) варьируют независимо друг от друга. Все изложенное выше позволяет сделать заключение о том, что обнаруженные варианты хромосом требуют тщательного изучения методом молекулярной диагностики.

Таким образом, молекулярно-цитогенетическая, или FISH-диагностика, хромосомной патологии у детей применялась в наших исследованиях в тех случаях, когда классические цитогенетические методы были малоэффективны: пост- и пренатальные трисомии аутосом; гоносомные анеуплоидии, включая мозаичные формы; маркерные хромосомы; структурные хромосомные аномалии, в том числе синдром ломкой хромосомы Х. При проведении молекулярно-цитогенетической диагностики использовали протокол быстрой (15-30 мин) FISH и оригинальную коллекцию центромерных, теломерных и сайтспецифичных ДНК-проб (плазмидных, космидных, РАС и YАС клонов). Проведенные исследования свидетельствуют, что молекулярно-цитогенетическая диагностика представляет собой новый и эффективный комплекс методов для выявления различных хромосомных аномалий в пре- и постнатальной диагностике. Следует также отметить, что FISH-анализ является важным дополнительным методом для определения различных форм хромосомных аберраций (маркерные хромосомы, различные формы хромосомных анеуплоидий и др.) и в комплексе с классической цитогенетической диагностикой позволяет резко повысить эффективность выявления хромосомной патологии у детей. Молекулярные исследования хромосомопатий имеют прикладное и теоретическое значение для педиатрии, поскольку позволяют выделять специфические хромосомные синдромы в обширной группе детей с недифференцированными формами умственной отсталости и врожденными пороками развития.

Выводы

1. FISH-диагностика - эффективный метод для идентификации различных хромосомных аномалий в пре- и постнатальной диагностике различных форм хромосомных нарушений.

2. FISH-анализ - необходимый дополнительный к классической цитогенетической диагностике метод для многих хромосомных аберраций (маркерные хромосомы, различные формы хромосомных анеуплоидий, включая мозаичные случаи, и т.п.). Многоцветовая FISH - быстрый, аккуратный и технически простой метод для пре-и постнатального определения аномалий с участием нескольких хромосом.

3. FISH-анализ, кроме прикладного медицинского аспекта, имеет важное фундаментальное значение для выделения новых и редких хромосомных синдромов в большой группе детей с умственной отсталостью и врожденными пороками развития.

Российский вестник перинатологии и педиатрии, N1-1998, с.31-36.

Литература

1. Вельтищев Ю.Е., Ведута О.Б., Ананенко А.А., Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б. Генно-инженерные методы в диагностике наследственных болезней. Вопр охр мат и дет 1987; 32: 41-46.

2. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б. Современные представления о ранней пренатальной диагностике наследственных болезней. Врожденные и наследственные заболевания у детей (Сборник на-учных трудов). МНИИПДХ. Минздрав РФ. М 1985; 126-134.

3. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Alexandrov I. A. et al. 18p-syndrome: an unusual case and diagnosis by in situ hybridization with chromosome 18-specific alphoid DNA sequence. Hum Genet 1986; 72: 185- 187.

4. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Kurbatov M.B., Kazantzeva L.Z. Translocation t (1; 17) (q12; q25) with a clinical picture like of a proximal deletion of 1q: identification by in situ hybridization with chromosome 1-specific satellite DNA probes. Hum Genet 1990; 86: 173- 174.

5. Юров Ю.Б., Александров И.А., Миткевич С.П. и др. Молекулярные маркеры для гетерохроматиновых районов хромосом человека. Хромосомы человека в норме и при патологии, МОИП. М 1989; 63-73.

6. Soloviev I.V., Yurov Y.B., Vorsanova S.G. et al. Prenatal diagnosis of trisomy 21 using interphase fluorescence in situ hybridization of postreplicated cells with site-specific cosmid and cosmid contig probes. Prenatal Diagnosis 1995; 15: 3: 237-248.

7. Yurov Y.B., Mitkevich S.P., Alexandrov I.A. Application of cloned satellite DNA sequences to molecular-cytogenetic analysis of con-stitutive heterochromatin in man. Hum Genet 1987; 76: 157-164.

8. Yurov Y.B., Soloviev I.A., Vorsanova S.G. et al. High resolution multicolor fluorescence in situ hybridization using cyanine and fluorescein dyes: ultra-rapid chromosome detection by directly fluorescently-labelled alphoid DNA probes. Hum Genet 1996; 97: 390-398.

9. Alexandrov I.A., Mitkevich S.P., Yurov Y.B. The phylogeny of human chromosome specific alpha satellite. Chromosoma 1988; 96: 443-453.

10. Soloviev I.V., Yurov Y.B., Malet P. et al. In situ hybridization of chromosome 21 specific alphoid cosmid clones. Life Sci. Advances Council of Sci Res Integration 1995; 14: 1-9.

11. Yurov Y.B., Laurent A.-M., Marcais B., Vorsanova S., Roizes G. Analysis of pericentromertic chromosome 21 specific YAC clones by FISH: identification of new markers for molecular-cytogenetic application. Hum Genet 1995; 95: 287-292.

12. Soloviev I.V., Yurov Y.B., Vorsanova S.G., Malet P. Microwave activation of fluorescence in situ hybridization: a novel method for rapid chromosome detection and analysis. Focus 1994; 16: 155-156.

13. Le Beau M. One FISH, two FISH, red FISH, blue FISH. Nature Genetics 1996; 12: 341-347.

14. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Александров И.А. и др. Молекулярно-цитогенетическая диагностика наследственных болезней, связанных с различными аномалиями хромосомы Х. Педиатрия 1989; 1: 76-80.

15. Buckton K.E., Spowart G., Newton M.S., Evans H.J. Forty probands with an additional "marker" chromosome. Hum Genet 1985; 69: 335-370.

16. Tozzi C., Calvieri F., Alesi L., Neri G. Multiple "marker" chromosomes: a novel cytogenetic findings in a patient with mental retardation and congenital anomalies. Am J Med Genet 1988; 29: 353- 349.

17. Callen D.F., Egre H.J., Ringniberg A. A dicentric variant of chromosome 6: characterization by use of in situ hybridization with biotinylated probe p308. Clin Genet 1990; 37: 81-83.

18. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Soloviev I.V. et al. Rapid identification of marker chromosomes by in situ hybridization under different stringency conditions. Anal Cell Path 1994; 7: 251-259.

19. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Passarge E. et al. Identification of marker chromosomes by in situ hybridization technique using alpha and "classical" satellite DNA probes weith relative chromosomal specificity. Цитология и генетика. Киев 1994; 28: 3: 67-70.

20. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Демидова И.А. и др. Молекулярно-цитогенетическая диагностика в педиатрии. Хромосомы человека в норме и при патологии, МОИП. М 1989; 73-82.

21. Демидова И.А., Ворсанова С.Г. Цитологический и молекулярный полиморфизм гетерохроматиновых районов хромосом человека. Медицинская генетика (Экспресс-информация). М 1990; 12: 1-9.