Ю. В. Постнов, Л. Е. Бакеева, В. Г. Цыпленкова, А. Ю. Постнов

Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава Российской Федерации,

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Ключевые слова:

митохондрии; миокард; спонтанная гипертензия крыс; эссенциальная гипертензия, биоэнергетика

Высказанное ранее предположение о причинной связи нарушений ионтранспортной функции клеточных мембран (мембранного "дефекта") при первичной гипертензии с дефицитом энергии, обеспечивающей в клетках противоградиентный транспорт ионов [1], находит подтверждение в изменениях содержания макроэргических фосфатов в тканях крыс со спонтанной гипертензией [2, 3] - признанной модели первичной (эссенциальной) гипертензии человека. Данные, полученные на тканях с невысокой интенсивностью энергетического обмена (печень, селезенка), указывают на отчетливое снижение энергетического заряда системы АТФ-АДФ-АМФ и отношения АТФ/АДФ в клетках этих тканей при спонтанной гипертензии по сравнению с нормотензивными крысами контрольной группы [2, 3]. В миокарде, отличающемся высоким уровнем энергетического обмена и критической зависимостью сократительной функции от поступления энергии, подобный сдвиг в клеточной энергетике при гипертензии менее выражен [2, 4], несмотря на рабочую перегрузку сердца и гипертрофию миокарда. Это обусловлено тем, что стабильный уровень АТФ поддерживается здесь мощной системой креатинфосфата, играющего роль энергетического буфера. Однако, по данным ряда исследований, более глубокие нарушения энергетики в миокарде крыс SHR проявляются в виде неполного восстановления энергетического метаболизма при реперфузии сердца после его ишемии [5] или под воздействием возрастающей перфузионной перегрузки сердца [6].

Рассматривая возможные причины нарушений клеточно-тканевой энергетики при первичной гипертензии вообще и в миокарде в частности, следует ранее всего определить причастность к этому митохондрий - клеточных органелл, играющих роль универсального поставщика энергии для осуществления практически всех клеточных функций, в том числе сокращения кардиомиоцитов, а также более общей задачи - обеспечения мембранным аппаратом клеток устойчиво неравновесного распределения ионов, т.е. поддержания константных величин градиентов ионных концентраций в цитоплазме клеток.

Несмотря на то что сердечная мышца является практически единственным объектом, в котором при первичной гипертензии (спонтанной гипертензии крыс) изучали митохондрии в отношении как ряда функциональных показателей [6], так и их структуры [7], большинство этих исследований связаны с выяснением особенностей гипертрофированного миокарда как характерного проявления хронической гипертензии.

Целью настоящего исследования было изучение ультраструктуры митохондриального аппарата кардиомиоцитов при спонтанной гипертензии крыс линии SHR и у крыс контрольной (нормотензивной) линии (WKY) с охватом основных этапов становления митохондриальной системы клеток в онтогенезе - от новорожденного животного до взрослого.

Материал и методы

Животные. В исследовании использовали инбредных крыс линии SHR (spontaneously hypertensive rats, Okamoto-Aoki strain) и крыс контрольной линии WKY (normotensive Wistar-Kyoto rats). Обе колонии содержались в питомнике лаборатории одного из авторов с 1973 г., куда были завезены из Монреальского института клинических исследований (SHR, 1973 г.) и из лаборатории профессора Y. Yamori (Kyoto, WKY, 1974 г.). Животных содержали на стандартном брикетированном корме при свободном доступе к воде.

В настоящей работе использовали крыс-самцов обеих линий (по 3 животных каждой линии) в следующие сроки жизни: 2, 4, 6 и 12 нед, а также новорожденных крыс, забитых в течение 2 ч с момента рождения (пол не определялся). АД (в мм рт.ст.) у 6- и 12-недельных крыс SHR было соответственно 135-140 (110-120 у WKY) и 150-170 (120-125 у WKY). Измерение давления (у 6- и 12-недельных) животных производили стандартным методом на хвосте с помощью резиновой манжеты, фотоэлектрического датчика и записи на полиграфе. Животных декапитировали под эфирным наркозом.

Методы

Изъятые тотчас после забоя кусочки миокарда левого желудочка фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде на фосфатном буфере, постфиксировали осмиевой кислотой и после дегидратации в спиртах возрастающей концентрации заключали в эпоксидную смолу. Ультратонкие серийные срезы готовили на ультрамикротоме LKB-V (Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном мироскопе JEM-100CX (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Результаты

При электронно-микроскопическом исследовании кардиомиоцитов у крыс со спонтанной гипертензией выявлены значительные изменения структурной организации митохондриального аппарата, относящиеся как к пространственной организации популяции митохондрий в кардиомиоцитах, так и к структуре составляющих ее митохондрий.

Важно отметить, что эти изменения, в разной степени выраженные, прослеживаются на протяжении всех исследованных сроков онтогенеза - от новорожденного до взрослого (12 нед) животного, прогрессируя с возрастом.

В кардиомиоцитах новорожденных крыс SHR по сравнению с контролем количество митохондрий уменьшено, они расположены в виде скоплений в зоне ядер (рис.1), не обнаруживая между собой никаких структурных соединений. Встречаются митохондрии, расположенные непосредственно в ядре, что может быть связано либо с наличием глубоких инвагинаций в мембране ядра, либо с присутствием замкнутых вакуолей внутри последнего. Существование подобных вакуолей показано для дрожжевых клеток [8]. При исследовании ультраструктуры кардиомиоцитов новорожденных крыс SHR при большем увеличении выявляются значительные изменения внутренней организации митохондрий. На электронно-микроскопической фотографии митохондриального кластера кардиомиоцита новорожденной крысы со спонтанной гипертензией (рис.2) эти органеллы отличаются округлой шаровидной формой, удлиненные митохондрии отсутствуют. Существенно изменена морфология крист: наряду с правильным, взаимно параллельным расположением в большинстве митохондрий кристы образуют ячеистую структуру. Матрикс митохондрий светлый, соответствующий состоянию незначительного набухания. В отдельных митохондриях в матриксе видны обширные электронно-прозрачные зоны. Исследование подобных митохондрий на серийных ультратонких срезах показывает, что эти органеллы имеют необычную организацию: наружная митохондриальная мембрана ограничивает отдельные компартменты (отсеки), образованные внутренней мембраной (рис.3). Подобные митохондрии определяют термином " септированные митохондрии ".

У 2-недельных крыс SHR число митохондрий возрастает, но они все еще располагаются в виде скоплений около ядер кардиомиоцитов. Внутренняя организация митохондрий усложняется: они имеют более развитую систему крист, но так же, как в митохондриях новорожденных крыс SHR, матрикс органелл просветленный, встречаются септированные митохондрии с электронно-прозрачными зонами в матриксе.

К 4-недельному возрасту у крыс SHR и крыс контрольной группы (WKY) окончательно формируется сократительная система кардиомиоцитов. Количество митохондриального материала резко увеличивается, основная масса митохондрий располагается рядами вдоль миофибрилл, однако нет объединения митохондрий в единую систему митохондриального ретикулума, характерную для кардиомиоцитов в норме [9]: митохондриальные контакты отсутствуют, несмотря на близкое расположение и непосредственное прилегание отдельных органелл (рис.4); митохондрии имеют светлый обводненный матрикс и округлую форму - признаки, указывающие на их набухание. Кроме этого, здесь также встречаются более крупные митохондрии с локальными электронно-прозрачными зонами в матриксе (септированные митохондрии).

У 6-недельных крыс SHR отчетливо различаются две популяции митохондрий. Основная масса митохондрий имеет просветленный матрикс, развитую систему крист, в которой, как и у новорожденных животных, выявляются изменения в пространственной ориентации складок внутренней мембраны. Кроме этого, в кардиомиоцитах присутствуют митохондрии, размеры которых во много раз превышают размеры основной популяции митохондрий (рис.5). Большую часть объема таких митохондрий занимает электронно-прозрачный матрикс, в котором просматриваются замкнутые мембранные пузырьки, вероятно, разрушенные кристы. Немного численные кристы выявляются только по периферии этих органелл (см. также ниже).

Рис. 1. Обзорная электронно-микроскопическая фотография миокарда новорожденной крысы SHR. Митохондрии образуют скопление в зоне ядер. Стрелкой отмечена митохондрия, расположенная в ядре. Х 12 000.

У 12-недельных крыс со спонтанной гипертензией изменения структуры митохондрий прогрессируют. На фоне основной популяции митохондрий, находящихся в состоянии умеренного набухания, резко выделяются митохондрии, которые по размерам во много раз превышают органеллы основной популяции (рис.6). По характеристикам эти структуры соответствуют известным в литературе мегамитохондриям [10]. При подробном ультраструктурном анализе обнаруженных мегамитохондрий выявлено многокамерное их строение. На рис.3,в показана мегамитохондрия, состоящая из 3 отдельных компартментов, ограниченных единой наружной митохондриальной мембраной. Механизм образования этих структур изучен недостаточно, в частности вопрос о том, являются ли мегамитохондрии следствием увеличения отдельных митохондрий или результатом их слияния. Полученные нами данные впервые позволяют достоверно показать один из механизмов образования мегамитохондрий. Так, рис. 3, а, б, в иллюстрирует основные этапы процесса поэтапного формирования мегамитохондрий. Как видно на электронно-микроскопических фотографиях рис. 3, в септированных митохондриях увеличивается количество компартментов, происходят резкое увеличение и обводнение пространства матрикса, деструкция крист, в результате чего образуются ограниченные двумя мембранами замкнутые полости значительных размеров. Подобные структуры иногда определяют как очаговую деструкцию либо "очаговую дегенерацию" кардиомиоцита или как "парциальный некроз" клетки, не связывая это явление с митохондриями.

Параллельно процессу образования мегамитохондрий из септированных форм митохондрий происходит развитие ультраструктуры основной популяции митохондрий от органелл небольшого размера (менее половины длины саркомера), с немногочисленными кристами у новорожденных крыс до крупных митохондрий, диаметр которых соответствует величине саркомера, с плотно упакованными кристами у взрослых животных.

Далее...