А.А.Чиркин

Витебский медицинский университет, Витебск, Беларусь

В начало...

Иммунные механизмы гепатотоксичности

Выделяют несколько основных механизмов повреждения печени посредством молекулярных механизмов, относящихся к иммунным реакциям: функционирование киллерных лимфоцитов и клеточных коопераций, образование неоантигенов и аутоантител, действие медиаторов (цитокины, оксид азота), активация системы комплемента.

1. Иммуноаллергическая гепатотоксичность

Электрофильные метаболиты могут ковалентно связываться с белками, образуя гаптены. Окислительное повреждение белков в результате образования или транслокации дисульфидных связей, а также окисления радикалов аминокислотных остатков ведет к формированию новых антигенных детерминант. Иммунный ответ возможен против гаптенов и неоантигенов. Аутоантитела выявляются при иммуноаллергических гепатитах, вызванных рядом лекарств. Например, токсичность анестетика галотана связана с иммуноопосредованным токсическим гепатитом: при метаболизме галотана образуется трифлюороацетилгалидин, который ковалентно модифицирует белки. Модифицированные белки оказывают 2 эффекта: 1) как антигены инициируют образование циркулирующих антител; 2) запускают лимфоцитоопосредованную цитотоксичность. По крайней мере, против 7 микросомальных полипептидов были обнаружены аутоантитела в сыворотке крови больных галотановым гепатитом [20]. Нестероидный противовоспалительный препарат диклофенак иногда вызывает тяжелый гепатит, поскольку при его метаболизме и конъюгации с глюкуроновой кислотой образуется электрофильный метаболит, который провоцирует иммунный ответ и повреждение гепатоцитов [22]. Метаболит этанола - ацетальдегид образует аддукты с белками гепатоцитов, которые как неоантигены определяют гепатотоксичность спирта [24].

2. Цитотоксические лимфоциты

Цитотоксичность лимфоцитов занимает видное место в патогенезе различных заболеваний печени. Выделяют, по крайней мере, два основных механизма проявления цитотоксичности лимфоцитов. Во-первых, Т-лимфоциты способны находить антигены клеток-мишеней, и активироваться при взаимодействии с ними. При этом выделяются цитотоксические гранулы, которые вызывают цитолиз клеток-мишеней. Гранулы содержат порообразующий белок - перфорин и гидролитические ферменты, известные как гранзимы (сериновые протеиназы, эстеразы и др.). Мономеры перфори на в присутствии ионов кальция полимеризуются и образуют комплекс, который внедряется в мембрану клетки-мишени, обеспечивая потерю ее непрерывнос ти. Поступление ионов кальция и гранзимов в цитозоль клетки-мишени ведет к ее гибели по механизму некроза [21, 32, 41]. Во-вторых, высказано предположение, что лимфоцит-опосредованная гибель клеток является процессом, не зависящим от присутствия ионов кальция. Полагают, что изменению проницаемости плазматической мембраны клеток-мишеней при межклеточном взаимодействии предшествует эндонуклеазный гидролиз ДНК (рецептор-опосредованный апоптоз посредством APO-1/Fas системы) [8, 12].

3. Цитокины

Образование цитокинов - это важный элемент поддержания гомеостаза организма. Однако, если имеется гиперпродукция цитокинов возможно повреждение печени. Большинство цитокинов образуется в печени при действии различных стимулов. Интерферон-gg продуцируется гепатоцитами в процессе вирусной инфекции. TNF-aa синтезируется клетками Купфера при действии целой гаммы гепатотропных повреждающих агентов. Провоспалительные цитокины TNF-aa, IL-1 и IL-6 секретируются клетками Купфера при гепатитах. Этот эффект сопряжен с синтезом белков острой фазы и повышением адгезии нейтрофилов в синусоидах. Эти же цитокины лежат в основе действия многих бактериальных эндотоксинов. Считают, что TNF-aa и IL-1 определяют механизмы некроза и нарушения транспортных систем, IL-6 стимулирует синтез белков острой фазы, IL-8 служит потенциальным хемоаттрактантом для нейтрофилов. Интерферон-gg и липополисахариды через индукцию NO-синтазы усиливают продукцию оксида азота, токсичного для внутриклеточных патогенных факторов (микобактерии, лейшмании) и опухолевых клеток пече- ни [6, 15, 29, 39, 42].

4. Система комплемента

Система комплемента состоит из каскада белков плазмы крови. Многие из них синтезируются в печени. Активация системы происходит при связывании С1-компонента с иммунным комплексом. Она cопровождается повышением фагоцитоза опсонизированных микробов (С3b), активацией клеток Купфера и нейтрофилов и др. Процесс служит для формирования атакующего мембрану комплекса на клеточной поверхности (С5b-C9). Этот механизм реализуется в печени при эндотоксемии, ишемии-реперфузии, действии свободных радикалов кислорода и иммунных реакциях [43].

5. Клеточные кооперации

Показано, что клетки Купфера играют важную роль в развитии повреждения печени. Септическое повреждение является одной из наилучших моделей изучения взаимодействия многих типов клеток. Можно описать следующую последовательность событий: повышение концентрации поступившего через портальную вену эндотоксина - активация клеток Купфера и освобождение ими хемоаттрактантов, включая интерлейкины, лейкотриен В4, С5-компонент комплемента - поступление нейтрофилов из циркуляции - активированные нейтрофилы с рецепторами молекул адгезии прилипают к синусоидальным эндотелиальным клеткам, а молекулы адгезии ICAM-1 и ELAM-1 способствуют миграции лейкоцитов в паренхиму печени - активированные нейтрофилы продуцируют свободнорадикальные формы кислорода, которые вызывают разные типы повреждения, например, активацию перекисного окисления мембран - макрофаги печени продуцируют токсические медиаторы и вызывают агрегацию тромбоцитов, что ведет к микротромбозам - узкие синусоиды тромбируются прилипшими нейтрофилами и тромбоцитами - развивается локальная гипоксия - появляются лобулярные некротические поражения [26].

Цитотоксичность ряда гуморальных факторов связана с особенностями синусоидальных эндотелиальных клеток. В отличие от других видов эндотелия, синусоидальный эндотелий фенестрирован и не имеет базальной мембраны. При печеночных вено-окклюзионных заболеваниях, после трансплантации костного мозга и некоторых других состояниях повреждение эндотелиальных клеток является начальным этапом Т-лимфоцит-опосредованной иммунной реакции. Сужение малых внутрипеченочных вен с откладыванием фибриногена и эритроцитов ведет к прекращению оттока крови, развивается ишемия печени со вторичным повреждением гепатоцитов. Некоторые лекарственные препараты (dacarbazine) и химические компоненты многих растений проявляют селективную токсичность по отношению к синусоидальным клеткам, инициируя развитие вено-окклюзионной патологии печени [7, 26].

Апоптоз

Апоптоз или "запрограммированная гибель клеток" является физиологическим процессом клеточного обновления. При апоптозе происходит сморщивание и конденсация хроматина и эндонуклеазная фрагментация ДНК без развития воспалительной реакции. Многие агенты способны индуцировать апоптоз. В неповрежденной печени апоптоз преимущественно наблюдается в ацинарной зоне 3. Апоптоз обнаруживают в процессе различных повреждений печени, но его регуляция не выяснена. Апоптоз развивается в отдельных клетках в отличие от некроза. В механизмах апоптоза важную роль играет рецепторная система CD95, которая способна экспрессироваться во многих клетках, включая гепатоциты. Считают, что связывание лиганда APO-1/ Fas с CD95 инициирует процесс апоптоза. Апоптоз является достаточно быстрым феноменом, например в печени крыс развитие апоптоза занимает 3 часа. Т-лимфоцитарная и естественная киллерная лимфоцитарная цитотоксичность часто реализуются через инициацию апоптоза. Другим триггером патологического апоптоза является фактор некроза опухолей. TNF является общим медиатором Т-лимфоцитарной и эндотоксиновой цитотоксичности. В отличие от некроза при апоптозе в гепатоцитах повышается синтез РНК и белков. Вероятно, это ответ на повышение активности ряда цитозольных и ядерных ферментов и, прежде всего, кальций, магний-зависимой эндонуклеазы и цитоплазматической кальций-зависимой трансглютаминазы. В процессе апоптоза часто отмечается увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция. Недавно обращено внимание на протеиназы семейства интерлейкин-1bb превращающих ферментов, действующих на ядерные белки. Эти эндонуклеазы и протеиназы вызывают межнуклеосомную деградацию ДНК ядер, но не ДНК митохондрий. Цитоплазматическая трансглютаминаза катализирует разрыв связей между остатками глютамина и лизина, что влияет на процессы агрегации органелл, конденсации цитоплазмы и ретракции целых клеток. Развитие апоптоза в гепатоцитах сопровождается изменениями в деятельности внутриклеточных сигнальных систем типа цАМФ и протеинкиназы С [26]. Наиболее интересные результаты получены при исследовании экспрессии генов, способных ингибировать или активировать запрограммированную гибель клеток, например, bcl-2, c-myc, p53, TRPM-2 гены, а также гены комплекса Fas-лиганд/Fas-APO-1-антиген. Установлено, что bcl-2 белок (молекулярная масса 25-26 кDа) располагается на внешней ядерной и митохондриальной мембранах и эндоплазматическом ретикулуме и действует как антиоксидант, ингибируя развитие апоптоза, вызванного перекисью водорода или истощением запасов глютатиона. Этот белок не найден в гепатоцитах, но обнаружен в малых желчных протоках. В гепатоцитах найден bax-белок, который рассматривается как ингибитор bcl-2. Гетеродимер bcl-2/bax способствует развитию апоптоза, а bcl-2 ингибирует процесс запрограммированной гибе ли гепатоцитов [9, 10, 30].

Оценка цитотоксичности лекарственных препаратов

Цитотоксичность различных веществ оценивают используя перфузию печени, срезы печени и изолированные гепатоциты. Наиболее стандартные результаты получаются на изолированных гепатоцитах. Используя гликохенодезоксихолевую кислоту как индуктор некро- за и апоптоза, оценивают антинекрозогенное или антиапоптозогенное действие изучаемых лекарственных препаратов. Выраженность некроза оценивают по выходу в инкубационную среду цитозольных ферментов, а проявления апоптоза оценивают по регистрации фрагментов ДНК методом электрофореза или визуаль но оценивают фрагментацию ДНК с помощью специальных красителей. Используя комбинацию красителей Annexin-V и пропидиум йодид, можно дифференцировать апоптотические, некротические и нормальные клетки: апоптотические клетки позитивны для Annexin-V и негативны для пропидиум йодида, некротические клетки позитивны, а нормальные клетки негативны для обоих красителей [1, 2, 30].

1. Данченко Е.О. Лабораторные методы оценки апоптоза и некроза // Медицинская панорама (Лабораторная медицина).-1999.-N3.-С. 18-19.

2. Чиркин А.А., Данченко Е.О., Луняк Н.К. Метаболическая терапия препаратами солянки холмовой. - М .:Фитос-1999.

3. Bautista A.P., Spitzer J.J. Inhibition of nitric oxide formation in vivo enchances superoxide release by the perfused liver // Am. J. Physiol. 266 (Gastrointest. Liver. Physiol. 29). - 1994. - G783-G788.

4. Bronk S.F., Gores G.J. pH dependent, non-lysosomal proteolysis contributes to lethal anoxic cell injury of rat hepatocytes // Am. J. Physiol. - 1993. - Vol. 264. - P. G744-G751.

5. Clancy R.M., Leszczynsca-Piziak J., Amin A. Et al. Nitric oxide ADP-ribosylates actin in association with the inhibition of cytoskeletal assembly neutrophils // J. Leukoc. Biol. - 1995. - Vol. 58. - P. 196-202.

6. Decker K. Biologically active products of stimulated liver macrophages (Kupffer cells) // Eur. J. Biochem. - 1990. - Vol. 192. P. 245-261.

7. Deleve L.D. Dacarbazine toxicit in murene liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1994. - Vol. 268. - P. 1261-1270.

8. Doherty P.C. Cell-mediated cytotoxicity // Cell. - 1993. - Vol. 75. - P. 607-612.

9. Fawthrop D.J., Boobis A.R., Davies D.S. Mechanisms of cell death // Arch. Toxicol.- 1991.- vol. 65.-P. 437-444.

10. Feldmann G. Liver apoptosis // J. Hepatol..- 1997.- vol. 26, Suppl. 2.- P. 1-11.

11 . Florine-Casteel K., Lemasters J.J., Herman B. Lipid order in hepatocyte plasma membrane blebs during ATP depletion measured by digitized video fluorescence polarization microscopy // FASEB J. - 1991.- Vol. 5.- P. 2078-2084.

12. Goldstein P., Ojclus D.M., Young D.-E. Cell death mechanisms and the immune system // Immunol. Rev. -1991. - Vol. 121. - P. 29-65.

13. Guengerich F.P. Enzymatic oxidation of xenobiotic chemicals // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. - 1990.-Vol. 25.-P. 97-153.

14. Herman B., Gores G.J., Nieminen A.L. et al. //Calcium and pH in anoxic and toxic injury. - Crit. Rev. Toxicol. - 1990. - Vol. 21. - P. 127-148.

15. Ioannidis I., Groot H. Cytotoxicity of nitric oxide in Fu5 hepatoma cells; evidence for co-operative action with hydrogen peroxide // Biochem. J. - 1993. - Vol. 296. - P. 341-345.

16. Jaeschke H. Mechanisms of oxidant stress-induced acute tissue injury // PSEBM - 1995. - Vol. 209. - P. 104-111. 17. Jungermann K., Katz N. Functional specialization of different hepatocyte populations // Physiol. Rev.-1989.-Vol. 69.-P. 708-764.

18. Kane A.B., Young E.E., Schanne F.A.X., Farber J.L. Calcium dependence of phalloidin-induced liver cell death // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1980.- Vol. 77.- P. 1177-1180.

19. Kedderis G.L. Biochemical basis of hepatocellular injury // Toxicol. Pathol. - 1996. -Vol. 24. - P. 77-83.

20. Kenna J., Satoh H., Christ D., Pohl L. Metabolic basis for a drug hypersensitivity: antibodies in sera from patients with halotane hepatitis recognize liver neoantigens that contains the trifluoroacetyl group derived from halotane // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1988.-Vol. 245. - P. 1103-1109.

21. Krahenbuhl O., Tschopp J. Perforin-induced pore formation // Immunol. Today. - 1991. - Vol. 12. - P. 399-402. 22. Kretz-Rommel A., Boelsterli U.A. Cytotoxic activity of T cells and non-T cells from diclofenac-immunized mice against cultured syngenic hepatocytes exposed to diclofenac //Hepatology.- 1995. -Vol. 22. - P. 213-222.

23. Lindros K.O., Penttila K.E. Digitonin-collagenase perfusion for efficient separation of periportal or perivenous hepatocytes // Biochem. J. - 1985.-Vol. 228.-P. 757-760.

24. Lindros K.O. Alcoholic liver disease: pathobiological aspects // J. Hepatol. - 1995.- Vol. 23. - P. 7-15. 25. Lindros K.O. Zonation of cytochrome P450 expression, drug metabolism and toxity in liver // Gen. Pharmac.-1997.-Vol. 28.-P. 191-196.

26. Losser M.-R., Payen D. Mechanisms of liver damage // Seminar in liver disease.-1996.-Vol. 16.- P.357-367.

27. Mirabelli F., Salis A., Vairetti M. et al. Cytoskeletal alterations in human platelets exposed to oxidative stress are mediated by oxidative Ca-dependent mechanisms // Arch. Biochem. Biophys. - 1989. - Vol. 270.- P - 478-488.

28. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells // FASEB J. - 1992. - Vol. 6. - P. 3051-3064.

29. Olynyk J.K., Matuschak G.M., Lechner A.J. et al. Differential production of TNF by Kupffer cells after phagocytosis of E. Coli and C. Albicans // Am. J. Physiol. 267 (Gastrointest. Liver Physiol. 30). - 1994. - G213-G219.

30. Patel T., Gores G. Apoptosis and hepatobiliary disease // Hepatology. - 1995. - Vol. 21. - P. 1725-1741.

31. Petronilli V., Cola C., Bernardi P. Modulation of the mitochondrial cyclosporine A-sensitive permeability transition pore. II. The minimal requirements for pore induction underscore a key role for transmembrane electrical potential, matrix pH and Ca // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol. 268. - P. 1011-1016.

32. Podack E.R., Hengartner H., Lichtenheld M.G. A central role of perforin in cytolysis? // Annu. Rev. Immunol. - 1991. - Vol. 9. - P. 129-157.

33. Rappaport A.M. Physioanatomical basis to toxic liver injury / in: Toxic injury of the liver, E. Farber, M. Fisher (eds). Marcel Dekker. 1979.-N.-Y.-P. 1-57.

34. Richter C., Kass G.E.N. Oxidative stress in mitochondria: Its relationship to cellular Ca homeostasis, cell death, proliferation, and differentiation // Chem.-Biol. Interact. - 1991. - Vol. 77. - P. 1-23.

35. Rollins B.J. Hepatic veno-occlusive disease // Am. J. Med. - 1986.-Vol. 81. P. 297-306.

36. Rosser B.G., Gores G.J. Liver cell necrosis: cellular mechanisms and clinical implications // Gastroenterology.-1995.-Vol. 108. P. 252-275.

37. Steinberg P., Lafranconi W.M., Wolf C.R. et al. Xenobiotic metabolizing enzymes are not restricted to parenchymal cells in rat liver // Mol. Pharmacol. - 1987.- Vol. 32.- P. 463-470.

38. Thomas C.E., Reed D.J. Current status of calcium in hepatocellular injury // Hepatology. - 1989. - Vol. 10. - P. 375-384.

39. Thornton A.E., Strieter R.M., Lindley I. et al. Cytokine-induced gene expression of a neutrophil chemotactic factor/IL-8 in human hepatocytes //J. Immunol. - 1989. - Vol. 144. - P. 2609-2613.

40. Tribble D.L., Aw T.K., Jones D.P. The pathophysiological significance of lipid peroxidation in oxidative cell injury // Hepatology. - 1987. - Vol. 7. - P. 377-387.

41. Tschopp J., Nadholz M. Perforin-mediated target cell lysis by cytolytic lymphocytes // Annu. Rev. Immunol. - 1990. - Vol. 8. - P. 279-302.

42. Wang J.H., Redmond H.P., Watson R.W.G., Bouchier-Hayes D. Role of lipopolysaccharide and tumor necrosis factor-aa in induction of hepatocyte necrosis // Am. J. Physiol. 269 (Gastrointest. Liver. Physiol.).-1995. - G297-G304.

43. Witthaut R., Farhood A., Smith C.W., Jaeschke H. Complement and tumor necrosis factor-aa contribute to MAC-1 (CD11b/CD18) up-regulation and systemic neutrophil activation during endotoxemia in vivo // J. Leukoc. Biol. - 1994. - Vol. 55. - P. 105-111.