Курсовая работа студентки 4-го курса кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ. Москва, 2001
Авторские права сохранены. Любое копирование данного текста и/или его фрагментов без разрешения автора запрещено и преследуется в соответствии с действующим законодательством РФ.

Содержание   В начало...
 
 

На основе системы двойных гибридов был разработан ряд методов изучения ДНК-белковых взаимодействий. Эти методы позволяют обнаруживать фрагменты ДНК, содержащие сайты связывания определенного ДНК-связывающего белка (26); идентифицировать белки, связывающиеся с определенными последовательностями ДНК (27); обнаруживать мутации, действующие на функцию ДНК-связывающих доменов (28).

7.1. Обнаружение активирующих последовательностей ДНК. Для обнаружения активирующих последовательностей ДНК конструируют две плазмиды (Рис. 3). Одна из них - репортерная плазмида, содержит последовательность гена HIS3 с измененным промотором. Этот промотор вместо собственной активирующей последовательности, необходимой для связывания активаторов транскрипции, содержит последовательности из ДНК-библиотеки. Данную библиотеку используют для скрининга на обнаружение в ней последовательностей, взаимодействующих с определенным белком.

Вторая плазмида - активирующая, кодирует гибридный белок, состоящий из интересующего ДНК-связывающего белка и активирующего домена дрожжевого белка GAL4. Специальный штамм дрожжей, несущий делецию эндогенного HIS3 гена, трансформируют этими плазмидами. Если происходит взаимодействие известного ДНК-связывающего белка с последовательностью ДНК, находящейся перед геном HIS3, то активируется транскрипция этого гена. Такие положительные клоны отбирают на среде без гистидина. Описанным способом фрагменты ДНК, способные связываться с активаторным белком могут быть отобраны из библиотеки геномных фрагментов (29). Для данного метода характерны ложноположительные результаты вследствие активации транскрипции репортерного гена HIS3 эндогенными факторами транскрипции дрожжей. Вторым этапом скрининга является идентификация трансформантов, в которых экспрессия HIS3 зависит от гибрида, кодируемого активирующей плазмидой. Для идентификации таких трансформантов используют два метода:

1) Активирующая плазмида содержит также ген ADE5, обеспечивающий красный цвет дрожжевых колоний. Колонии, не несущие этого гена, имеют красный цвет с белыми секторами (30).

2) Активирующая плазмида содержит дополнительный ген URA3. Положительные колонии переносят методом "отпечатков" на среду, содержащую 5'-флюорооротную кислоту (5-FOA), токсичную для клеток, несущих URA3 ген. Положительные колонии, активация транскрипции гена HIS3 в которых зависит от активирующей плазмиды, идентифицируют по их неспособности расти в присутствии 5-FOA (31).

Изолированные фрагменты ДНК могут быть классифицированы по их сравнительной транскрипционной активности. Для этого измеряют экспрессию HIS3 при помощи 3-АТ - конкурентного ингибитора фермента, кодируемого HIS3 (32). Измеряя количество 3-АТ, необходимого для ингибиции роста положительных колоний в отсутствие гистидина, определяют относительную транскрипционную активность фрагментов ДНК, находящихся в промоторе гена HIS3 (33). В приведенном методе вместо гибридов с активирующим доменом GAL4 могут быть использованы напрямую любые белки, которые могут действовать в дрожжах как транскрипционные факторы.

Обнаруженные таким способом фрагменты ДНК могут затем использоваться для определения распознаваемой последовательности активирующего белка и для обнаружения потенциальных генов-мишеней для данного активирующего белка. Исследуя большое количество фрагментов ДНК, содержащих сайты связывания определенного ДНК-связывающего белка, возможно, определить консенсусную последовательность для данного сайта связывания (33).

Основным преимуществом этого метода является возможность его применения для обнаружения генов-мишеней, находящихся под контролем определенных активирующих последовательностей ДНК.

Метод обладает определенными ограничениями. Было показано, что отбор на экспрессию гена HIS3 очень чувствителен. Это может привести к выявлению неспецифических взаимодействий. В таких случаях используют репортерные плазмиды, содержащие дополнительный ATG кодон в начале гена HIS3 (33).

7. 2. Идентификация ДНК-связывающих белков Свойства системы двойных гибридов используют при идентификации белков, взаимодействующих со специфическими последовательностями ДНК (33). Метод используют, когда известна последовательность ДНК, связывающаяся с белком, но ген, кодирующий данный белок не известен. Исследуемую последовательность ДНК помещают в промоторную область репортерного гена так, чтобы она регулировала экспрессию репортерного гена (При этом, собственную активирующую последовательность данного репортерного гена удаляют). Конструкцию затем вставляют в дрожжи, создавая новый репортерный штамм. Конструируют плазмиду, кодирующую гибридный белок активирующего домена фактора транскрипции и последовательностей библиотеки к-ДНК. Полученный вектор вводят в репортерный штамм и исследуют экспрессию репортерного гена. Гибридные белки, связывающиеся с исследуемой последовательностью ДНК, способны активировать транскрипцию репортерного гена. Последовательности ДНК-связывающего белка получают из положительных клонов и исследуют дальше (7).

7. 2. Метод обнаружения ДНК-связывающих доменов. Был также разработан метод обнаружения ДНК-связывающих доменов белков (34). Данный метод позволяет обнаруживать мутации, нарушающие ДНК-связывающую способность белка. Этот метод используют для определения аминокислот, необходимых для сохранения структуры и/или функции ДНК-связывающего домена. Таким способом можно идентифицировать ДНК-связывающие домены, содержащие нераспознаваемые ДНК-связывающие мотивы. Когда локализация ДНК-связывающего домена в белке известна, этот метод позволяет обнаружить аминокислоты, вовлеченные в связывание ДНК (29).

Анализируемый ДНК-связывающий домен (белок X) синтезируют как часть трифункционального белка, который также содержит ДНК-связывающий домен LexA и активирующий транскрипцию домен GAL4. Этот гибридный белок связывается с операторной последовательностью LexA, находящейся в промоторе гена HIS3 в репортерной плазмиде, и активирует экспрессию данного гена. Это обеспечивает отбор колоний, в которых происходит взаимодействие, на среде без гистидина. Полученный гибрид также активирует экспрессию хромосомального GAL1 гена, содержащего сайты связывания для белка Х (Х-сайты). Использование гена GAL1 обеспечивает негативную селекцию колоний, в которых происходит данное взаимодействие, поскольку экспрессия GAL1 при определенных условиях токсична для клеток дрожжей. GAL1 кодирует галактокиназу, катализирующую первый этап расщепления галактозы - образование галактозо-1-фосфата (Gal-1-P). При блокировании дальнейшего превращения Gal-1-P мутацией гена GAL10 (GAL10 кодирует фермент, катализирующий второй этап расщепления галактозы) происходит накопление Gal-1-P, которое является токсичным для клеток дрожжей (35). В описанном методе используют штамм дрожжей, содержащий мутации хромосомных копий генов HIS3 и gal-lO. Полученные трансформанты, содержащие оба репортерных гена и синтезирующие действующий LexA-X-GAL4 гибридный белок, являются HIS+ , но чувствительны к галактозе (29).

Мутанты, содержащие дефектный ДНК-связывающий домен белка X, не способный взаимодействовать со своим сайтом связывания, определяют путем отбора на среде без гистидина по устойчивости к галактозе. Необходимость в сохранении мутантов, положительных по гистидину, ограничивает выявление бессмысленных мутаций, мутаций со сдвигом рамки или мутаций, дестабилизирующих гибридный активирующий белок (29).

8. Обратная система двойных гибридов, определяющая диссоциацию белок белковых взаимодействий

Для эффективного анализа мутаций во взаимодействующих белках, также как для идентификации факторов, вызывающих диссоциацию белок белковых и ДНК-белковых взаимодействий можно использовать иной подход. Данный метод называют обратной системой двойных гибридов. Он основан на негативной селекции различных событий, вызывающих нарушения белок белковых и ДНК-белковых взаимодействий (20).

Были сконструированы репортерные штаммы дрожжей, в которых экспрессия взаимодействующих гибридных белков или гибридного ДНК-связывающего белка, взаимодействующего с определенной последовательностью ДНК, была токсичной при определенных условиях. В этих условиях диссоциация взаимодействия дает клеткам дрожжей селективные преимущества, что облегчает выявление подобных событий (20).

В качестве гена, токсичного для клеток при определенных ростовых условиях, может быть использован дрожжевой ген URA3, кодирующий фермент, вовлеченный в биосинтез урацила. Клетки дрожжей, экспрессирующие данный ген способны расти на среде без урацила. Однако URA3-кодируемый фермент может также катализировать превращение 5-флюорооротной кислоты (FOA) в токсичный агент. Экспрессия URA3 является токсичной для дрожжей, растущих на среде, содержащей FOA. При таком подходе, трансформанты, содержащие взаимодействующие белки не будут расти на среде с урацилом и FOA, a трансформанты, в которых взаимодействие гибридных белков не происходит вследствие мутаций, или оно блокировано неким экзогенным фактором, можно отобрать на данной среде (20).

Далее...