Литературный обзор курсовой работы студентки 4-го курса кафедры генетики Биологического факультета МГУ. Москва, 2001
Авторские права сохранены. Любое копирование данного текста и/или его фрагментов без разрешения автора запрещено и преследуется в соответствии с действующим законодательством РФ.

Содержание   В начало...
 
 

Неоднократно указывалось, что генетическая предрасположенность вносит значительный вклад в развитие В-ХЛЛ. Сообщалось об однояйцевых близнецах, независимо развивших В-ХЛЛ [Conley C.L. et al., 1980]. Отмечена высокая частота возникновения В-ХЛЛ в одних и тех же семьях [Linet M.S. et al., 1989]. Показано, что в семьях, где имеется более чем один индивид, пораженный В-ХЛЛ либо родственным лимфопролиферативным заболеванием, некоторые члены семьи имеют недостаточность антител либо другие повреждения иммунной системы, в том числе аутоиммунные заболевания [Fraumeni J.F. et al., 1975].

Несмотря на сравнительно большое число пациентов, доступных для анализа, о генах, вовлеченных в развитие В-ХЛЛ известно сравнительно немного. Долгое время возможности цитогенетического анализа на образцах В-ХЛЛ были ограничены из-за низкой митотической активности злокачественых В-клеток и их слабым ответом на митогенные стимулы. Однако, после открытия поликлональных В-клеточных митогенов (липополисахарид, 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат, митоген фитолакки) стало возможным проведение широкомасштабных цитогенетических исследований В-ХЛЛ.

Те или иные кариотипические изменения выявлены у 50 % пациентов с В-ХЛЛ [Juliusson G. et al., 1990]. Такие изменения в половине случаев представлены одним повреждением, в четверти случаев в хромосомах содержатся два повреждения, а в оставшихся случаях выявлены комплексные хромосомные изменения [Juliusson G. and Gahrton G., 1993]. Наличие различных хромосомных изменений у одного больного (комплексный кариотип) при В-ХЛЛ является неблагоприятным прогностическим фактором [Juliusson G. et al., 1990].

Впервые структурные аномалии хромосомы 13 у больных В-ХЛЛ были описаны в 1987 году [Fitchett M. et al., 1987]. По данным [Juliusson G. et al., 1991] 10% случаев В-ХЛЛ сопровождаются делециями и транслокациями 13q14, заметными на кариотипическом уровне. Как известно, именно в этом районе хромосомы 13 расположен ген-супрессор опухолевого роста RB1. Этот ген, играющий критическую роль в регуляции клеточного цикла, и привлек первоочередное внимание исследователей. С помощью молекулярно-биологических методов, гемизиготные делеции RB1 были определены у 21-38% (усредненное по числу исследованных образцов значение 30%) пациентов с В-ХЛЛ [Liu Y. et al., 1992; Liu Y. et al., 1993; Liu Y. et al., 1995; Hawthorn L.A. et al., 1993]. Однако, оказалось, что точечные мутации этого гена у больных В-ХЛЛ встречаются крайне редко, что позволяет исключить RB1 из числа возможных кандидатов на роль гена - супрессора опухолевого роста, повреждаемого при В-ХЛЛ.

В дальнейшем было показано, что хромосомный маркер D13S25, расположенный на 1.6 сМ теломернее гена RB1, подвержен делециям у 18 - 60 % (среднее значение - 41%) пациентов, а в одной из работ даже у 90% [Brown A.G. et al., 1993]. Делеция обеих аллелей D13S25 наблюдалась в 7 - 44% случаев [Brown A.G. et al. 1993, Stilgenbauer S. et al., 1995; Liu Y. et al., 1993; Liu Y. et al., 1995]. Тем не менее, у некоторых пациентов наблюдались делеции гена RB1, не затрагивающие локус D13S25, что указывает на присутствие искомого гена-супрессора, специфического для В-ХЛЛ и расположенного в области между RB1 и D13S25. С помощью метода LOH (потери гетерозиготности микросателлитных маркеров) размер области пересечения делеций был определен в 280 т. п. н. [Devilder M.C. et al., 1995]. Наибольшая частота делеций при В-ХЛЛ падает на хромосомный маркер D13S319 [Liu Y. et al., 1995; Corcoran M.M. et al., 1998].

В работе Garcia-Marco обнаружено, что "горячей точкой" хромосомных перестроек при В-ХЛЛ является район 13q12.3, расположенный центромернее гена RB1 [Garcia-Marco J.A. et al., 1996]. Однако, эти данные не были подтверждены другими исследователями [Panayiotidis P. et al., 1997; Corcoran M.M. et al., 1998].

2.2.2. РАЙОН 13Q14.3 И РАСПОЛОЖЕННЫЙ В НЕМ ГЕН RFP2

Делеции района q14 хромосомы 13 являются одним из наиболее частых цитогенетических изменений, обнаруживаемых у больных В-ХЛЛ. С помощью делеционного картирования была определена критическая область, ограниченная хромосомными маркерами D13S1168 и D13S25, расстояние между которыми составляет 620 т.п.н. К настоящему моменту в рамках работы по транскрипционному картированию, в данной области выявлены гены DLEU1, DLEU2, RFP2, с13orf1 (chromosome 13 open reading frame 1) и PLCC (Putative Large CLL Candidate), а также большое количество EST, соответствующих потенциальным новым генам, принадлежащим к данному региону. Для генов DLEU1, DLEU2, RFP2 был проведен мутационный скрининг (SSCP анализ) на опухолевых образцах больных B-клеточным хроническим лимфолейкозом на двух независимых выборках больных, однако мутаций в этих генах не обнаружено.

Среди выше перечисленных генов наиболее интересным является RFP2, клонированый в лаборатории анализа генома в 1998 году [Kapanadze B.I. et al., 1998]. Ген RFP2 кодирует белок, состоящий из 407 аминокислот. Этот белок содержит цинк-связывающие домены RING и B-box, а также так называемый "спирально скрученный" домен. Такое сочетание доменов называется RFP-подобным трехчастным доменом, по названию белка RFP (Ret finger protein). К настоящему моменту открыто более десяти белков, принадлежащих к этому семейству. Многие из этих белков принимают участие в процессах канцерогенеза, регуляции иммунного ответа и раннем эмбриональном развитии многоклеточных организмов.

Степень гомологии (P-value) аминокислотных последовательностей RFP2 и RFP, определяемая вероятностью случайного совпадения позиций аминокислотных остатков, составляет 3.7e-15. Белок RFP приобретает онкогенные свойства, когда его трехчастный домен в результате транслокации состыковается с содержащим тирозин-киназный домен протоонкогеном Ret [Cao T. et al., 1997]. Белок RFP способен мультимеризоваться за счет взаимодействия "спирально скрученных" доменов, B-box также вносит вклад в белок-белковое взаимодействие, хотя и не участвует в нем непосредственно. Белок Rfp способен взаимодействовать с другим членом того же семейства - белком PML, кодируемым геном, ответственным за развитие острой промиелоцитарной лейкемии [Cao T. et al., 1998]. Как и белок RFP, белок PML также имеет сходство с продуктом, кодируемым геном RFP2 (собственные данные). Белки RFP и PML локализован в одних и тех же ядерных тельцах (nuclear bodies) и участвуют в процессах клеточного роста и дифференциации [Cao T. et al., 1998]. В другой работе было установлено взаимодействие RFP с мышиным белком Int-6, также локализованным внутри PML-содержащих ядерных телец [Morris-Desbois C. et. al., 1999]. Представляется интересным обнаруженное взаимодействие между белком RFP и продуктом гена человека, являющегося гомологом гена дрозофилы, изветсного под названием Enchancer of Polycomb (EPC). Методом двугибридной дрожжевой системы показано образование прочной связи между спирально-скрученным доменом RFP с C-концевым участком белка EPC. С помощью люциферазной системы показано, что репрессия транскрипции репортерных генов происходит вне зависимости от того, какие были использованы энхансеры и промотеры, а собственная репрессирующая активность белка RFP гораздо выше, чем у белка EPC. Спирально-скрученный домен RFP и C-концевой участок EPC являются основными участниками процесса репрессии транскрипции, тогда как домен EpcA обладает способностью к активации транскрипции [Shimono Y. et al., 2000]. При помощи двугибридной дрожжевой системы, а также методов определения белок-белкого взаимодействия in vitro установлено образование комплекса между белком RING1 (также являющимся гомологом гена RFP2), и белками группы Polycomb, известными под назваиями HPC2 и BMI1. Показано, что оверэкспрессия гена RING1 приводит к строгой репрессии гена En-2. [ Satijn et al.,1998].

Не менее интересны и другие белки, в высокой степени гомологичные RFP2. Так, наибольшую степень гомологии (P-value = 6.9e-24) к RFP2 имеет белок XPRF, продукт гена MID1, ответственного за развитие синдрома Опитца (G/BBB), возникающего из-за тяжелого нарушения морфогенеза у человека. Белок XPRF вовлечен в такие фундаментальные процессы, как закладка органов эмбриона и контроль пролиферации клеток [Quaderi N.A. et al., 1997; Gaudenz K. et al., 1998]. Другой белок, гомологичный RFP2, Rpt-1 (P-value = 5.1e-18) - это внутриклеточный протеин, обнаруженный в покоящихся Т-хелперных лимфоцитах мыши. Он связывает промотор и регулирует экспрессию гена рецептора интерлейкина-2, а также связывает длинные концевые повторы вируса иммунодефицита человека HIV-1 [Patarka, R. et al., 1988]. Человеческий белок Staf-50 (stimulated trans-acting factor of 50 kDa) (P-value = 1.9e-15) похож по своему действию на Rpt-1 [Tissot C. and Mechti N., 1995]. Он индуцируется интерферонами I и II и регулирует транскрипцию других генов. Имеет аминокислотное сходство с RFP2 (P-value = 8.1e-12) и так называемый Ro SS/A белок, антитела к которому присутствуют в крови пациентов с такими аутоиммунными заболеваниями, как синдром Шегрена, системная красная волчанка и волчанка новорожденных [Chan E.K. et al., 1991; Sibilia J., 1998]. Патогенное действие Ro SS/A антител приводит к повреждениям кожи у взрослых людей и остановке сердца у новорожденных. Белок Ro SS/A входит в состав рибонуклеопротеиновых комплексов, находящихся в большинстве человеческих тканей и клеток, в том числе клетках крови. Качественный и количественный состав этих комплексов варьирует в зависимости от тканевой принадлежности клетки и стадии эмбрионального развития. Облучение УФ и вирусные инфекции приводят к перемещению Ro SS/A-содержащих комплексов из ядра в цитоплазму и даже к мембране клетки, что приводит к усилению аутоиммунных реакций у пациентов.

Белковое семейство Rfp, к которому принадлежит белок RFP2, эволюционно консервативно. Белки, в высокой степени гомологичные RFP2, обнаружены у гребенчатого тритона Pleurodeles waltii, шпорцевой лягушки Xenopus laevis, и даже у нематоды Caenorhabditis elegans. Белок гребенчатого тритона A33 (P-value = 1.6e-20) - это ядерный белок, расположенный на петлях "ламповых щеток" хромосом [Bellini M., 1993]. Он связан с новосинтезированными транскриптами, что предполагает его участие в процессе синтеза пре-мРНК либо в процессинге. Белок шпорцевой лягушки XNF7 (P-value = 2.8e-16) способен связываться с двуцепочечной ДНК [Reddy B.A. et al., 1991]. Этот белок сохраняется в цитоплазме ооцита лягушки со времени его созревания и вплоть до эмбриональной стадии средней бластулы. На стадии средней бластулы он перемещается из цитоплазмы в ядро, что приводит к запуску генетической программы определения дорсально-вентральной симметрии и закладке мезодермы [El-Hodiri H.M. et al., 1997]. Миграция XNF7 между ядром и цитоплазмой регулируется его фосфорилированием митоген-активируемыми киназами и циклином В/cdc2 [El-Hodiri H.M. et al., 1997a]. Функциональные свойства белка F54G8.4 (P-value = 4.4e-11), обнаруженного в ходе масштабного проекта по определению нуклеотидной последовательности генома C.elegans, пока не определены.

Суммировав вышеизложенные данные, следует отнести белок RFP2 к семейству Rfp-подобных белков, содержащих трехчастный домен, и предположить, что, подобно другим описанным членам этого семейства, белок RFP2 способен связывать нуклеиновые кислоты и образовывать белковые комплексы. Интересно, что все ближайшие гомологи белка RFP2 вовлечены в те или иные процессы, связанные с клеточной дифференциацией или регуляцией раннего развития эмбриона. Следует предположить, что и RFP2 принимает участие в одном из этих процессов. Участки аминокислотной последовательности белка RFP2 и белков, в высокой степени гомологичных белку RFP2, приведены на Рис.1.

В отличие от своих гомологов ген RFP2 остается еще мало изученным и представляет большой интерес как кандидат на роль супрессора опухолевого роста, повреждаемого при В-ХЛЛ. В данной работе впервые приведено подробное описание геномной организации гена RFP2, его альтернативных мРНК изоформ, эндогенного антисмыслового транскрипта, начало которого расположено в 5' -регуляторной области данного гена, и предпринята попытка поиска белковых партнеров RFP2 с помощью дрожжевой двухгибридной системы.