Новый математический подход при определении концентрации антибиотиков методом диффузии в агар

Государственный научный центр по антибиотикам, Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва.

В начало...

Экспериментальная часть

Мясо-пептонный бульон (в г/л): пептон - 10, NaCl - 5, вода мясная - 0,5 л, вода дистиллированная до 1 л. рН (8,1- 8,2) устанавливали 10% раствором NaOH, при этом наблюдается выпадение осадка, который отделяли фильтрацией через бумажный фильтр, подкисляли 10% раствором соляной кислоты до значений рН 7,4-7,5 (что на 0,1-0,2 единицы выше, чем требуется). Стерилизовали при 0,05 МПа в течение 30 мин.

Питательная агаровая среда N 1. Мясо-пептонный бульон (МПБ) с содержанием аминного азота 40-80 мг% - 1 л, агар-агар - 12 г, KH₂PO₄ - 3 г. рН до стерилизации 8,0, после стерилизации 6,8-7,0.

Питательная среда N 2. Применяли для выращивания вегетативной формы Bacillus subtilis 720. МПБ - 330 мл, агар-агар - 30 г, вода дистиллированная до 1 л. рН до стерилизации 8,0, после стерилизации 7,8-8,0.

Питательная среда N 3. Применяли для получения спор культуры Bacillus subtilis 720. Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 40-90 мг% - 1л, агар-агар - 25 г. рН до стерилизации 6,4. Стерилизация при 0,05 МПа в течение 30 мин. После стерилизации отстаивали в течение 1-2 ч, сливали прозрачный слой, остаток фильтровали. Разливали по 250-300 мл в матрацы и стерилизовали повторно. После стерилизации рН 6,0-6,2.

Приготовление суспензии тест-культуры

Тест-культуру Bacillus subtilis 720 высевали в пробирки со средой N 1 и помещали в термостат на 18-24 ч, после чего выросшую тест-культуру переносили петлей в пробирку со стерильной дистиллированной водой, затем пипеткой одну каплю суспензии переносили на чашку Петри со средой N 2, растирая ее по поверхности стеклянным шпателем и этим же шпателем переносили оставшуюся на нем культуру последовательно из чашки в чашку, с тем чтобы получить отдельные колонии. Чашки помещали в термостат на 24 ч. Затем на скошенную в пробирках среду N 2 отсевали изолированные колонии, имеющие складчатую поверхность и неровные изрезанные края. Пробирки помещали в термостат на 18-24 ч, после чего культуру со скошенного агара смывали 5-10 мл стерильной дистиллированной воды. Полученную суспензию клеток переносили в матрац со средой N 3 и равномерно распределяли по поверхности среды. Засеянный матрац выдерживали в термостате при температуре 37 1?С в течение 5-7 суток до обильного спорообразования. В матрац вносили стерильную дистиллированную воду для смыва спор. Споры промывали не менее 3 раз стерильной дистиллированной водой. Полученную взвесь спор прогревали при температуре 60-70?С в течение 30 мин.

Подготовка чашек с питательной средой и тест-культурой

В 100 мл расплавленной и охлажденной до 60-65?С питательной агаровой среды N 1 вносили 0,5 мл взвеси спор Bacillus subtilis 720 (1 млрд/мл по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и разливали в чашки Петри по 20 мл. После застывания чашки подсушивали в течение 30 мин и делали на расстоянии 28-30 мм от центра по окружности чашки шесть лунок диаметром 8 мм (специальным приспособлением).

Приготовление стандартного раствора тилозина

Навеску 0,02-0,03 г стандартного образца тилозина взвешивали с точностью до четвертого знака, растворяли в этиловом спирте, чтобы получить концентрацию 0,01 г/мл. Затем разводили дистиллированной водой, имеющей рН 6,8-7,0, до концентрации 1000 мкг/мл, из этого раствора готовили контрольный стандартный раствор с концентрацией 3 мкг/мл и два рабочих раствора с концентрацией 1,5 и 6 мкг/мл.

Приготовление разведений исследуемых образцов

Пробу культуральной жидкости (2 мл) разводили в 10 раз стерильной дистиллированной водой и фильтровали через бумажный фильтр или центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин. Фильтрат разводили стерильной дистиллированной водой чтобы получилось три разведения с коэффициентом геометрической прогрессии в интервале от 1,2 до 2. Разведения готовили таким образом, чтобы ККС примерно была равна второму разведению и обязательно находилась между минимальным и максимальным разведением. Разведения готовили в стерильных пробирках.

Проведение испытаний

Контрольный стандартный раствор (3 мкг/мл) вносили автоматической пипеткой по 0,1 мл в три лунки чашки. В другие три лунки вносили три разведения фильтрата, также по 0,1 мл. Лунки со стандартным раствором чередовали с лунками с испытуемым фильтратом. Аналогичным образом поступали с тремя разведениями стандарта. Для получения статистически достоверного результата для каждого испытуемого образца брали не менее трех чашек. После закапывания чашки выдерживали не менее двух часов при комнатной температуре для диффузии анализируемых растворов в агар, чтобы сгладить временные различия при их нанесении. Затем чашки помещали в термостат на 16-18 ч. Через указанное время измеряли зоны задержки роста тест-культуры контрольным стандартным раствором и разведениями испытуемого фильтрата. В случае образования зон диаметром меньше 15 мм или более 21 мм для контрольного стандартного раствора уменьшали или увеличивали нагрузку тест-культуры. Если диаметры зон разведений испытуемых образцов не укладывались в указанные пределы, мы увеличивали или уменьшали разведения образцов.

Обработка результатов

На основании экспериментальных данных, полученных для трех разведений анализируемого образца, определяли выполнение требования линейной зависимости диаметра зон подавления от логарифма дозы антибиотика:

d_n = a_i + b_i * lg P_n (1a)

где d_n - среднее значение диаметра зон подавления роста при соответствующем разведении (d₁, d₂,..., d_n); P_n - доза антибиотика в анализируемой пробе, выраженная в единицах разведения (P₁, P₂,..., P_n); a_i,b_i, - коэффициенты в уравнении (1а), характеризующие индивидуальную зависимость d_n от lg P_n для i-того анализируемого образца.

Методом наименьших квадратов определяются по уравнениям (2)-(4): a_i = (d_n - b_i * lg P_n)/n (2)

b_i = [lgP_n * d_n - (lgP_n * d_n)/n]/[(lgP_n)² - (lgP_n)²/n] (3)

r_i = [lgP_n * d_n - (lgP_n * d_n)/n]/[(lgP_n)² - (lgP_n)²/n] * [d_n² - (d_n)²/n] (4)

Определение коэффициентов a_i, b_i и коэффициента корреляции r_i в соответствии с уравнениями (2) - (4) проводили по стандартным программам, которые, наряду с самыми простыми персональными ЭВМ, имеются в сборниках программ к программируемым микрокалькуляторам (ПМК), например к "Электронике-МК52".

Расчет концентрации тилозина в испытуемом образце проводили в следующей последовательности. Замеряли диаметры зон, образуемые контрольным стандартным раствором и тремя разведениями испытуемого образца. Находили среднее значение величины зоны для контрольного стандартного раствора для каждой чашки и по всем чашкам, определяли поправочный коэффициент для чашек, d_st которых отличается от среднего значения диаметра стандарта по всем чашкам. Для удобства расчетов и наглядности лучше построить таблицу (табл. 1).

Таблица 1. Расчетные параметры
Номер чашки	Разведения			Kонтрольная концентрация стандарта 3 мкг/мл
	Р1	Р2	Р3
Диаметры зон подавления роста
1-я	d11	d21	d31	dst(1-3)1
...	...	...	...	...
j-я	d1j	d2j	d3j	dst(1-n)j
Средние значения диаметра зон по всем чашкам	d1	d2	d3	dst(1-n*j)

Если коэффициент корреляции имеет величину не менее 0,99, то это указывает на выполнение зависимости по уравнению (1) в эксперименте, а определенная в этих условиях концентрация тилозина в анализируемом образце будет определена с относительной ошибкой не более 5%.

Концентрацию тилозина в нанесенных на чашку разведениях и взятом для анализа образце культурального фильтрата определяли по уравнениям (5)-(7):

lg c_n = lg c_st + ( d_st(nj) - d_n)/b_i (5)

antilg c_n = c_n (6)

c_i (мкг/мл) = (c₁ * P₁ + c₂ * P₂ + ... + P_n * c_n) * m/n * 1000 (7)

Количественное определение тилозина в готовом продукте и сухих образцах

Из точной навески препарата в 25...30 мг готовили водные растворы с концентрацией 50, 25 и 12,5 мкг/мл. Экспериментальную линейную зависимость диаметра зон подавления (d_n) анализируемого образца от логарифма концентраций (lga_n) определяли так же, как для культуральной жидкости. Поскольку, в отличие от используемых ранее разведений, между d_n и lga_n существует прямая зависимость, то коэффициент b_i > 0, а концентрация тилозина в мкг/мл определяется по уравнениям (8) и (9):

lg c_n = lg c_st + (d_n - d_st(nj))/b_i (8)

antilg c_n = c_n (6)

C_i (мкг/мл) = ( c₁/a₁ + c₂/a₂ + c₃/a₃) * m/n, где (9)

C_i - концентрация тилозина в анализируемом препарате в мкг/мг;

c₁,c₂,..., c_n - экспериментально определенные концентрации тилозина в мкг/мл в n (трех) разведениях анализируемого препарата по международному стандарту с активностью m (в мкг/мг);

a₁,a₂,..., a_n - весовые концентрации анализируемого препарата в мкг/мл, взятые для анализа.

Пример. Из навески 30,1 мг тилозина фосфата приготовили три водных раствора с концентрацией 60, 30 и 15 мкг/мл. Полученные растворы по 0,1 мл закапывали в лунки трех чашек вместе со стандартом, как это описано в разделе "Проведение испытаний". Полученные экспериментальные данные представлены в табл. 2

Таблица 2. Экспериментальные данные
Номер чашки	Весовые концентрации			Kонтрольная концентрация стандарта 3 мкг/мл	dst (1-n)j	dst(1-nj)
	60	30	15
диаметры зон подавления роста, мм
1-я	21,0	18,5	16,0	18,5 18,0 18,0	18,2	0
2-я	21,0	18,0	16,0	18,0 18,0 19,0	18,3	-0,1
3-я	21,0	18,5	15,0	18,0 18,0 18,5	18,2	0
Среднее значение диаметра зон стандартного раствора для n = 9 равно 18,2 мм
После корректировки величины диаметров зон подавления (для второй чашки)
1-я	21,0	18,5	16,0	18,5 18,0 18,0	18,2
2-я	20,9	17,9	15,9	17,9 17,9 18,9	18,2
3-я	21,0	18,5	15,0	18,0 18,0 18,5	18,2
Средние значения диаметра зон по всем чашкам	21,0	18,3	15,6	18,2

После введения средних диаметров зон подавления и соответствующих им логарифмов концентраций, например в программу Statgraf, получили r_i = 1, b_i = 8,96861. Подставив полученные экспериментальные величины в уравнение (8), мы можем определить концентрацию тилозина в каждом из трех растворов анализируемого образца:

lg c_n= lg c_st + (d_n - d_st(nj))/b_i = 0,4771 + (d_n - 18,2)/8,96861;

для a₁ = 60 мкг/мл, d₁ = 21,0 мм; c₁ = 6,16 мкг/мл;

для a₂ = 30 мкг/мл, d₂ = 18,3 мм; c₂ = 3,08 мкг/мл;

для a₃ = 15 мкг/мл, d₃ = 15,6 мм; c₃ = 1,54 мкг/мл.

Учитывая, что в стандарте содержится 905 мкг/мг основания тилозина А, определим среднюю концентрацию тилозинов в анализируемом образце в единицах активности тилозина А:

C_i = (c₁/a₁ + c₂/a₂ + c₃/a₃) * m/n = (6,16/60 + 3,08/30 + 1,54/15) * 905/3 = 92,9 мкг/мг.

Далее...