Научная Сеть >> Новые продуценты L-глутаматоксидазы Streptomyces litmocidini и Streptomyces cremeus

Наука >> Медицина | Научные статьи

Написать комментарий

Добавить новое сообщение

См. также

L-Глутаматоксидаза стрептомицетов: применение в клинической и фундаментальной медицине: ЛИТЕРАТУРА

Новые продуценты L-глутаматоксидазы - Streptomyces litmocidini и Streptomyces cremeus

М.Е. Додзин, К.А. Виноградова, И.Б. Котова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

В начало...

(Окончание)

Стабилизация и повышение ферментативной активности выделенных штаммов

Определение оптимального способа поддержания активности продуцентов. При хранении обоих штаммов на косяках с овсяным агаром при 4?С без пересевов их ферментативная активность остается стабильной, не снижаясь в течение 6 месяцев. За 22 месяца хранения в тех же условиях ферментативная активность штамма 447 снизилась в 5 раз - с 0,078 до 0,017 ед/мл. Для стабилизации ферментативной активности в условиях хранения и для получения более активных вариантов проводили периодические рассевы выделенных продуцентов с последующей проверкой активности. Путем отбора на основе естественной изменчивости получены варианты штамма 447, активность культуральной жидкости которых составляла 120-130% от исходной.

Рассевы штамма 510 на основе естественной изменчивости также дали положительные результаты - получены варианты, обладающие активностью 0,24-0,25 ед/мл, что составляло 160% от исходной.

Повышение L-глутаматоксидазной активности в ходе факторных экспериментов по оптимизации состава ферментационной среды. Оптимизация ферментационной среды является существенно более эффективным методом повышения биосинтетической активности культуры. Был проведен "оценочный"-факторный эксперимент со штаммом 510, в ходе которого был проверен ряд компонентов ферментационной среды для определения наиболее значимых для синтеза L-глутаматоксидазы параметров (табл. 3). В качестве посевной использовали стандартную для всех вариантов среду П (см. "Материал и методы"). Анализ результатов "оценочного" ПФЭ позволяет сделать ряд практических выводов:

- пептон - более эффективный фактор синтеза L-глутаматоксидазы, чем дрожжи;

- отсутствие соевой муки в среде приводит к резкому снижению уровня биосинтеза L-глутаматоксидазы;

- содержание KСl и MgSO₄ в среде в изученном диапазоне концентраций не оказывает значимого влияния на синтез L-глутаматоксидазы штаммом 510.

С учетом этих выводов была рассчитана схема ПФЭ-2⁴ (табл. 4). В качестве 4 факторов варьирования были взяты соевая мука (Х₁), крахмал (Х₂), пептон (Х₃), глюкоза (Х₄), содержание остальных компонентов ферментационной среды было зафиксировано на оптимальном (по результатам предыдущего эксперимента) уровне.

Таблица 4. Схема ПФЭ-2⁴ по оптимизации ферментационной среды для штамма 510

Вариант Соя X₁ Kрахмал X₂ Пептон X₃ Глюкоза X₄ K₂HPO₄ NaCl CaCO₃ Активность 4-е сутки Активность 5-е сутки

OD ед/мл OD ед/мл

1 1,5 1,5 1,5 2,0 0,1 0,25 0,3 0,026 0,014 0,112 0,062

2 1,0 1,5 1,5 2,0 0,1 0,25 0,3 0,007 0,004 0,112 0,062

3 1,5 1,0 1,5 2,0 0,1 0,25 0,3 0,017 0,009 0,115 0,064

4 1,0 1,0 1,5 2,0 0,1 0,25 0,3 0 0,000 0,090 0,050

5 1,5 1,5 1,0 2,0 0,1 0,25 0,3 0 0,000 0,121 0,067

5а (50 мл среды/колбу) 1,5 1,5 1,0 2,0 0,1 0,25 0,3 0,057 0,032 0,185 0,103

6 1,0 1,5 1,0 2,0 0,1 0,25 0,3 0,007 0,004 0,140 0,078

7 1,5 1,0 1,0 2,0 0,1 0,25 0,3 0,023 0,013 0,135 0,075

8 1,0 1,0 1,0 2,0 0,1 0,25 0,3 0,017 0,009 0,113 0,063

9 1,5 1,5 1,5 1,0 0,1 0,25 0,3 0,049 0,027 0,270 0,150

10 1,0 1,5 1,5 1,0 0,1 0,25 0,3 0 0,000 0,303 0,168

11 1,5 1,0 1,5 1,0 0,1 0,25 0,3 0,015 0,008 0,190 0,106

12 1,0 1,0 1,5 1,0 0,1 0,25 0,3 0 0,000 0,065 0,036

13 1,5 1,5 1,0 1,0 0,1 0,25 0,3 0 0,000 0,360 0,200

14 1,0 1,5 1,0 1,0 0,1 0,25 0,3 0 0,000 0,275 0,015

15 1,5 1,0 1,0 1,0 0,1 0,25 0,3 0,063 0,035 0,125 0,069

16 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,25 0,3 0,027 0,015 0,155 0,086

17 (контроль) 1,25 1,25 1,25 1,5 0,1 0,25 0,3 0,018 0,010 0,293 0,163

Исходная среда - 1,5 1,0 MgSO₄ - 0,05 0,1 - KCl - 0,05 0,061 0,034 0,082 0,046

В результате эксперимента удалось вычислить коэффициенты уравнения регрессии - математической модели зависимости функции Y (L-глутаматоксидазная активность культуры) от концентрации в ферментационной среде компонентов Х₁, Х₂, Х₃, Х₄:

b₀ = 168, b₁ = +11, b₂ = +44, b₃ = -10, b₄ = -50;

Соответственно, уравнение регрессии выглядит следующим образом:

Y = 168 + 11X₁ + 44X₂ - 10X₃ - 50X₄

Из уравнения следует, что увеличение относительно среднего уровня (вариант 17) содержания в среде факторов Х₁ (соевая мука) и Х₂ (крахмал), и, соответственно, снижение содержания факторов Х₃ (пептон) и Х₄ (глюкоза) должно дать значимый положительный эффект. Следовательно, эксперимент, в котором в серии вариантов ферментационной среды одновременно, с определенным шагом, будут снижаться концентрации "отрицательных" компонентов и увеличиваться концентрации "положительных" компонентов, должен привести к решению поставленной задачи - получению оптимальной по составу среды. Величина шага $\lambda$ * движения по градиенту концентраций факторов в среде рассчитывалась по стандартной методике, исходя из значений коэффициентов регрессии [13] (табл. 5).

Таблица 5. Расчет $\lambda$ * для "крутого восхождения"

Показатель Х₁ Х₂ Х₃ Х₄

b_n 11 44 -10 -50

$\lambda$ _n 0,25 0,25 0,25 0,50

b_nx $\lambda$ _n 2,75 11,0 -2,5 -25

Основной уровень 1,25 1,25 1,25 1,50

K 1,1 4,4 -1,0 -10

$\lambda$ * 0,01 0,04 -0,01 -0,10

Поскольку ПФЭ-2⁴ (см. табл. 4) показал, что соотношение объемов воздух/среда в колбе оказывает значимое влияние на глутаматоксидазную активность культуральной жидкости (увеличение аэрации среды в варианте "5а" повысило уровень биосинтеза фермента почти в 1,5 раза), в дальнейшем перешли на культивирование в 50 мл среды.

В результате эксперимента по плану "крутого восхождения" была разработана ферментационная среда следующего состава (в %): соевая мука - 1,30; растворимый крахмал - 1,45; полипептон - 1,20; глюкоза - 1,00; K₂HPO₄ - 0,10; NaCl - 0,35; CaCO₃ - 0,80; pH 7,6. На данной среде L-глутаматоксидазная активность штамма 510 составила 0,253 ед/мл, что более чем в 5 раз превысило среднюю активность на исходной среде "Ф". Чем ниже был уровень активности разных вариантов штамма 510 на среде "Ф", тем сильнее был эффект от оптимизации среды.

Для подтверждения достигнутых результатов был проведен контрольный эксперимент на двух ферментационных средах (исходной "Ф" и "оптимальной"), подтвердивший эффективность оптимизации на основе математического планирования эксперимента. Неожиданным оказался такой же положительный эффект для штамма 447 - активность на оптимальной для штамма 510 среде превышала контроль в 1,6 раза.

Выводы

1. Выделены из почвы и идентифицированы 2 новых штамма-продуцента L-глутаматоксидазы: Streptomyces cremeus шт. 510 и Streptomyces litmocidini шт. 447.

2. С применением метода "математического планирования эксперимента" проведена оптимизация состава ферментационной среды, что позволило увеличить L-глутаматоксидазную активность продуцентов более чем в 5 раз по сравнению с исходной на стандартной среде.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1998-N4, стр. 7-13.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kamei T. L-Glutamate oxidase from Streptomyces violascens. I. Production, isolation and some properties. Chem Pharm Bull 1983; 31: 4: 1307-1314.

2. Kusakabe H., Midorikawa Y., Yamauchi H. L-Glutamic acid oxide, its production and its use. Eur Pat 1989; 0097949: 24.

3. Chen C.Y., Su Y.C. Amperometric L-glutamate sensor using a novel L-glutamate oxidase from Streptomyces platensis NTU 3304. Anal Chem Acta 1991; 243: 9-15.

4. Ishikawa H., Misaki H., Muto N. L-Glutamate oxidase (H₂O₂-generative), its production and method therefor. 1986; US 4: 605: 615: Pat 18.

5. Passarge M., Bohmer A., Stangel C. et al. Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen (H₂O₂-bildenden) L-Glutaminsoure-oxidase 1988; Pat DD: 261932 A3: 4.

6. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Изд 2-ое./Под ред Звягинцева Д.Г. М 1991.

7. Бондарцев А.С. Шкала цветов. М 1954: 27.

8. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М 1983; 245.

9. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology./9-th ed 1989; 4: 2648.

10. Shirling E.B., Gottlieb D. Cooperative description of type cultures of Streptomyces. II. Species descriptions from first study. Intern J System Bact 1968; 18: 2.

11. Shirling E.B., Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species. Ibid1966; 16: 313-319.

12. Tresner H.D., Backus E.J. System of color wheels for Streptomycete taxonomy. Appl Microbiol 1963; 11: 4: 335-338.

13. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М 1969; 126.

14. Approved Lists of Bacterial Names./Sherman V.B.D., McGovan V., Sneath P.H.E., eds. Intern J System Bact 1980; 30: 1: 225-420.

15. Li Q., Wang L., Li Y. Color development with rational screening method for improvement of L-glutamate oxidase-producing strains. Enzyme Microbiol Technol 1996; 18: 1: 7-9.

Антибиотики и химиотерапия

Написать комментарий