Витрификация человеческого эмбриона в продвинутой стадии развития

A. Stecher^*, P. Vaderzwalmen^**, I. Riedler^*, N. Zech^*, H. Zech^*

^*Institute fur Reproduktionsmedizin und Endokrinologie, Austria;

^**SIMAF, Belgien

В начало...

Ключевые слова:

витрификация, эмбрион, выживаемость, частота беременности.

В лечении бесплодия использование глубокого замораживания эмбрионов широко распространено. Криоконсервация считается приемлемым решением для сохранения лишних эмбрионов, образующихся в ходе ЭКО (экстракарпоральное оплодотворение), для последующей имплантации и уменьшения опасности многоплодной беременности. При низких температурах эмбрионы сохраняются в жизнеспособном состоянии, и их метаболическая активность не нарушается. Существует два основных способа глубокого замораживания эмбрионов:

1. Метод контролируемой медленной криоконсервации (постепенная криоконсервация), которую ввел в 1971 Whittingam;

2. Несбалансированная криоконсервация с а) ультрабыстрой криоконсервацией и б) витрификацией, которая была разработана в 1985 г. Rall и Fahy на эмбрионах мышей.

I. Контролируемая медленная криоконсервация является в настоящее время обычным методом консервации человеческих эмбрионов. Их охлаждают медленно, чтобы произошла дегидратация клеток, и уменьшилось образование больших внутриклеточных кристаллов льда. Криопротекторы осмотически <вытягивают> из клетки воду, которая замерзает в межклеточном пространстве. Клетка не может быть дегидратирована очень сильно, без повреждения эмбриона внутриклеточным осмотическим давлением. Чтобы предотвратить дегидратацию, добавляют растворы, непроникающие внутрь эмбриона (например сахарозы). При медленном охлаждении клетка остается в равновесии с замерзшим раствором и при этом дегидрируется. Существует опасность повреждения эмбриона из-за межклеточной и внутриклеточной кристаллизации, если клетки охлаждаются слишком быстро. Кроме того, растущая концентрация межклеточного раствора может вызвать токсическое повреждение эмбриона.

Для медленной криоконсервации необходимы дорогостоящие приборы, значительную роль играет фактор времени.

II(а). При ультрабыстрых методах замораживания эмбрионы, находящиеся в растворе 3,5-4,5 М DMSO (диметилсульфоксид) и 0,25-0,5 М сахарозы, помещают в жидкий азот. При этом образуются мелкие кристаллы льда, менее стабильные, чем большие тающие при более низких температурах; при медленном оттаивании возможна их агрегация в большие кристаллы.

II(б). При витрификации значительно упрощается не только процесс охлаждения, исключается опасность физических и химических повреждений, вызванных межклеточной и внутриклеточной кристаллизацией.

Под витрификацией понимают переход жидкости в твердое состояние, который вызван не кристаллизацией, а экстремальным повышением вязкости во время охлаждения. Витрификационная жидкость состоит из смеси высококонцентрированного проникающего криопротектора (DMSO, ацетамид, пропиленгликоль, глицерол, этиленгликоль) и непроникающего криопротектора (полиэтиленгликоль, фиколл, сахароза) в буферном солевом растворе. Концентрация криопротектора так высока, что при очень быстром охлаждении до -196?С вязкость сильно увеличивается.

Цель исследования выяснить применим ли метод витрификации на человеческих эмбрионах. Нами были проанализированы влияние стадии развития, дальнейшее развитие эмбриона после оттаивания, а также частота имплантации после витрификации и оттаивания.

Материалы и методы

Для проверки токсичности проведены наблюдения за выживаемостью после витрификации и оттаивания морул/бластоцист после оплодотворения патологического с образованием одного или трех пронуклеусов.

Данные эмбрионы были получены после культивирования in vitro аномально (одно- или трех-пронуклеарно) оплодотворенных яйцеклеток. Также были использованы эмбрионы плохого качества.

После этого культивировали часть морфологически нормальные двухдневные эмбрионы в среде S2 (Scandinavian IVF Science AB) до возраста 4-6 дней. Морулы/ бластоцисты были криоконсервированы методом витрификации и после оттаивания перенесены пациенткам.

Витрификация проводилась по методу Махмудзадеха в 2 этапа. Все растворы были основаны на PBS-HSA (солевой раствор фосфатного буфера с человеческим сывороточным альбумином).

Выбранные эмбрионы были эквилибрированы при комнатной температуре в 20% (v/v) этиленгликоле (=EG 20) в течение трех минут. Затем их поместили во второй раствор, который состоял из 40% (v/v) этиленгликоля, 18% (w/v) фикола и 0,3М сахарозы (EFS). После краткой экспозиции в этом растворе эмбрионы поместили в соломинку 0,25 мл. Соломинка была сначала заполнена примерно на 3,5 см 0,5М раствора сахарозы, затем следовал слой воздуха толщиной около 9 мм и примерно 2,5 см EFS, в котором находились эмбрионы. Затем снова следовал слой воздуха толщиной около 9 мм и соломинка была заполнена до конца 0,5М раствора сахарозы, закупорена порошком и сразу же помещена в жидкий азот (соломинка изображена на рис. 1). Время между переносом эмбрионов в раствор EFS и помещением в жидком азоте выдерживалось как можно меньше (максимально 60 с.).

Рис. 1. Соломинка после заполнения.

Эмбрионы оттаивали на водяной бане при 40?С в течение 10 с, после чего содержимое соломинки выливалось в раствор 0,25 М сахарозы. После 3 мин эквилибрирации витрификационный раствор удаляли путем промывания эмбрионов в среде S2. Дальнейшее культивирование in vitro для наблюдений или последующего выполнения ПЭ проводилось также в среде S2.

Результаты

В табл. 1 обобщены результаты испытаний на токсичность витрификационного раствора человеческих аномально оплодотворенных эмбрионов, находящихся на стадии морулы или бластоцисты. Из 7 морул и 5 бластоцист все эмбрионы (100%) обнаружили после витрификации и оттаивания более чем 80% интактных бластомеров. 3 из 7 морул развились далее в бластоцисты (43%), 2 развились в экспандированные бластоцисты (29%). Одна из 5 бластоцист осталась в стадии ранней бластоцисты (20%), 3 из 5 достигли стадии экспандированной бластоцисты (60%).

Таблица 1. Тест на токсичность: выживаемость in vitro аномально оплодотворенных человеческих морул и бластоцист после эквилибрирации (3 мин в EG 20 и 1 мин в EFS)
Стадии развития эмбриона	Число эквилибрированных эмбрионов	Число оттаянных выживших эмбрионов		Число развившихся эмбрионов
		>80% интактных бластомеров	>50% интактных бластомеров	Бластоцисты	Экспандированные бластоцисты
Морула	7	7 (100%)	0	3/7 (43%)	2/7 (29%)
Бластоциста	5	5 (100%)	0	1/5 (20%)	3/5 (60%)

Выживаемость in vitro человеческих эмбрионов плохого качества после двухэтапной витрификации представлена в табл. 2.

Таблица 2. Выживаемость in vitro витрифицированных человеческих эмбрионов плохого качества после двухэтапной витрификации (3 мин в EG 20 и 1 мин в EFS)
Стадии развития эмбриона	Число эквилибрированных эмбрионов	Число оттаянных выживших эмбрионов		Число развившихся эмбрионов
		>80% интактных бластомеров	>50% интактных бластомеров	Бластоцисты	Экспандированные бластоцисты
Морула	8	4 (50%)	3 (38%)	2/7 (29%)	2/7 (29%)
Бластоциста	7	4 (57%)	2(29%)	2/6 (33%)	2/6 (33%)

Из 8 витрифицированных морул выжили 50% (4) с более чем 80% интактных бластомеров, 38% (3) показали более чем 50% интактных бластомеров. 2 из этих 7 (29%) морул развились в бластоцисты и 2 из 7 (29%) в экспандированные бластоцисты. Из 7 витрифицированных бластоцист выжили 57% (4) с более чем 80% интактными бластомерами, 29% (2) показали более чем 50% интактных бластомеров. 2 из 6 бластоцист (33%) остались в стадии бластоцисты, и 2 из 6 (33%) развились в экспандированные бластоцисты.

Далее...