Перколяция чужеродной ДНК в геном при оплодотворении

А.В. Кузнецов, А.Б. Жаданов, И.В. Кузнецова, И.Ю. Щит

ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск, Московская область, Институт молекулярной биологии РАН, Москва

В начало...

Ключевые слова:

ДНК, сперматозоиды, ферментативная активность.

В предшествующих экспериментах мы обрабатывали спермии кролика плазмидой рRK3lасZ, искусственно осеменяли крольчих и наблюдали экспрессию гена lасZ в доимплантационных эмбрионах до стадии морулы включительно [8]. В настоящей работе была предпринята попытка получить трансгенных животных. Поскольку имеются факты, свидетельствующие о существовании в клетках эукариот селекции, которая направлена против вирусных и бактериальных последовательностей ДНК [9, 10], в опытах использовали разные формы плазмиды pRK3lacZ.

Материалы и методы

Конструирование плазмиды pRK3lacZ. Регуляторную область RSV-LTR вырезали из плазмиды pRSV-lacZ [11] рестриктазами NdeI и HindIII, обрабатывали фрагментом Кленова в присутствии dNTP и клонировали в затупленный сайт XbaI плазмиды pUC19. В результате была получена плазмида pRSV1. Концевую область гена bGH с участками сплайсинга и полиаденилирования вырезали из плазмиды pGL3 [12] рестриктазами PstI и KpnI и клонировали в сайт SmaI вектора pUC19 описанным выше способом. Получили плазмиду pK3. Далее плазмиды pRSV1 и pK3 расщепили смесью рестриктаз BamHI и HindIII, выделили фрагменты, содержащие RSV-LTR и bGH-pUC19, а затем лигировали их. Таким образом, получили вектор pRSVK3, содержащий все необходимые участки для транскрипции и созревания молекул мРНК. Из плазмиды pLZ4 [13] с помощью рестриктаз BamHI и SalI вырезали полусинтетический ген -галактозидазы E.coli. Участок ДНК с геном lacZ обрабатывали фрагментом Кленова и клонировали в предварительно затупленный BamHI-caйт вектора pRSVK3. Полученную плазмиду назвали pRK3lacZ (рис. 1). В экспериментах по трансформации использовали HindIII, KpnI-рестрикты плазмиды pRK3lacZ или смесь кольцевых и линейных молекул ДНК в соотношении 4:1.

Рис. 1. Физическая карта плазмиды pRK3lacZ. Плазмида pRK3lacZ состоит из следующих частей: 3'-фрагмент длинного концевого повтора провируса саркомы Рауса (RSV-LTR), который содержит сигналы инициации транскрипции; полусинтетический ген lacZ, кодирующий бактериальный фермент -галактозидазу; 3'-концевой участок генагормона роста быка (bGH), содержащий сигналы сплайсинга, полиаденилирования и терминации транскрипции; вектор pUC19.

Подготовка сперматозоидов и осеменение крольчих. Кроличью сперму получали от половозрелых самцов породы советская шиншилла с помощью искусственной вагины. Кроликов содержали в следующем половом режиме: 1 садка не чаще, чем в 3 дня, и не реже, чем в неделю. В эксперименте использовали эякуляты, содержащие не менее 80% подвижных спермиев. Активные сперматозоиды отделяли от неподвижных флотацией в 10-кратном объеме раствора Эрла. Суспензию подвижных клеток дважды центрифугировали при 200 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в растворе Эрла (содержит 50 мМ CaCl₂ и 100 мМ KCl) и разводили до конечной концентрации 107 клеток в 1 мл. К 500 мкл суспензии добавляли в 50 мкл буфера ТЕ HindIII, KpnI-рестрикты ДНК pRK3lacZ или смесь указанных линейных фрагментов плазмиды с ее кольцевой формой и тщательно перемешивали. Далее сперматозоиды инкубировали 15-30 мин при комнатной температуре (естественная трансформация), либо проводили инкубацию в присутствии 3% диметилсульфоксида (DMSO) с последующей температурной обработкой (4^oC → 42^oC, 2 мин) или без нее (искусственная трансформация). Самок в фазе эструса осеменяли при помощи катетера трансформированными спермиями. Сразу после осеменения внутривенно вводили по 100 МЕ хорионического гонадотропина. Контрольные эксперименты осуществляли без использования ДНК pRK3lacZ.

Выделение геномной ДНК [14]. Измельченные кусочки тканей (50 мг) инкубировали на качалке при 50^оС в течение ночи в 700 мкл раствора следующего состава: 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 100 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 1% SDS, 100 мкг/мл протеиназы К ("Sigma", США). Утром добавляли 5 мкл РНКазы А (1 мг/мл, "Sigma") и инкубировали при 37^оС в течение 1 ч. Далее вносили 700 мкл фенола, насыщенного ТЕ, и осторожно перемешивали до гомогенного состояния в течение 20 мин. Фазы разделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин. К верхней вязкой водной фазе приливали 700 мкл смеси фенол-хлороформ (1:1, об/об), уравновешенной ТЕ и содержащей 1:50 (об/об) изоамилового спирта, аккуратно перемешивали и центрифугировали при тех же условиях. К верхней фазе добавляли 1 мл 96% этанола, аккуратно перемешивали и осаждали ДНК центрифугированием (8000 об/мин, 15 мин). Осадок промывали 1 мл 70% этанола, снова центрифугировали, подсушивали в вакууме и растворяли в 200 мкл ТЕ, инкубируя на качалке в течение 2 ч при 37^оС. Если величина отношения А₂₆₀/А₂₈₀ в образце была ниже 1,7, проводили повторную экстракцию смесью фенол-хлороформ. Целостность высокомолекулярной ДНК проверяли электрофорезом в 0,8% агарозном геле [15].

Подготовка радиоактивного гибридизационного зонда. ДНК pRK3lacZ метили [-³²P] ATP (ИЯФ, Обнинск) при помощи реакции ник-трансляции, используя ник-набор фирмы "Fermentas" (Литва), согласно инструкции производителя. Активность ДНК [³²P]-pRK3lacZ составляла 10¹⁰ имп/мин х мл. К зонду добавляли ДНК из спермы лосося (100 мкг/мл) и денатурировали на кипящей водяной бане в течение 10 мин.

Иммобилизация хромосомной ДНК на фильтре [16]. Капроновые мембраны "Хииу-калур" (Эстония) предварительно выдерживали 15 мин в 10хSSPE. ДНК-пробу (10 мкг) и контрольныеразведения плазмиды pRK3lacZ смешивали с 10 мкг ДНК из спермы лосося, денатурировали нагреванием в течение 10 мин при 95^оС и наносили в точки при помощи прибора Dombi-Dot (Диа-М, Россия). Связанную ДНК пришивали к высушенным фильтрам под УФ-лампой на расстоянии 15 см в течение 20 с.

Рестрикция хромосомной ДНК эндонуклеазой EcoRI, Саузерн-блотинг [15]. Образцы ДНК по 10 мкг гидролизовали 200 ед. рестриктазы EcoRI при 37^оС в течение ночи и разделяли при помощи электрофореза в 0,8% агарозе. Денатурацию ДНК в геле проводили в течение 1 ч с помощью буфера, содержащего 0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl. Далее гель нейтрализовали в буфере: 1 М Трис-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl. Капиллярный перенос ДНК-фрагментов на нейлоновые фильтры Hybond-N ("Amersham", Англия) осуществляли с помощью 10хSSC в течение 12 ч.

Гибридизация и радиоавтография [17]. Предгибридизацию проводили в течение 2 ч при 65^оС в растворе следующего состава: 5хSSPE, 0,3% SDS,100 мкг/мл ДНК из спермы лосося. Гибридизацию с зондом осуществляли в том же растворе при 65^оС в течение ночи. Фильтр четырежды отмывали при 45^оС по 10 мин в 250 мл раствора: 2хSSPE, 0,2% SDS. Радиоавтографию проводилис рентгеновской пленкой РМ-1 ("Тасма", Россия) в присутствии усиливающих экранов в течение 1 и 4 нед при -20^оС.

Определение -галактозидазной активности. Ферментативную активность бактериальной -галактозидазы (КФ 3.2.1.23) определяли по цветной реакции с хромогенным субстратом CPRG ("Boehringer Mannheim", Германия). Для этого сыворотку крови анализируемых животных смешивали в соотношении 1:4 (об/об) с раствором следующего состава: 3,29 мМ CPRG, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 0,1% NaN₃ (масса/об), 1% BSA (масса/об), 150 мкг/мл хлороквина, 100 мМ HEPES (pH 7,0) и инкубировали при 30^оС в течение ночи. Интенсивность окрашивания оценивали спектрофотометрически (ламбда=574 нм).

Результаты

Общие итоги опыта, результаты точечной гибридизации с зондом [³²P]-pRK3lacZ. Эксперименты по обнаружению перенесенной спермиями кролика ДНК pRK3lacZ у новорожденных особей, взрослых животных и их потомков проводили в 1992-1993 гг. Опробовали приемы естественной и искусственной трансформации сперматозоидов. Было проведено 3 серии опытов.

Серия 1. Эякулят получали от кроликов N 1-4. Отмытые от семенной жидкости сперматозоиды инкубировали с HindIII, KpnI-рестриктами плазмиды pRK3lacZ (5-10 мкг/мл) в течение 15-30 мин при комнатной температуре в растворе Эрла. После этого суспензию клеток разбавляли тем же раствором и проводили искусственное осеменение. Из 10 самок животные A2, A3, A8 и A9 родили 26 крольчат, которые были исследованы при помощи дот-гибридизации на содержание чужеродных последовательностей ДНК. Положительные сигналы зарегистрированы не были.

Серия 2. В опыте использовали сперму от самцов N 2-4. После флотации и отмывки клеток от семенной плазмы в растворе Эрла к ним дробно добавляли DMSO - сначала до 1%, а через 10 мин инкубации спермиев при комнатной температуре с 10 мкг/мл плазмиды pRK3lacZ, линеаризованной по HindIII и KpnI сайтам, - до 3%. Затем суспензию охлаждали в течение 20 мин до 4^oC и проводили тепловой шок (42^oC, 2 мин). В результате осеменения крольчих D7-D14 было получено 35 крольчат, из которых 29 особей исследовали с помощью дот-гибридизации. Как и в предыдущем случае, позитивные животные выявлены не были.

Серия 3. С целью отмыть спермии от семенной жидкости эякуляты кроликов N 3-5 обрабатывали при помощи флотации и центрифугирования. Во всех вариантах опыта трансформацию сперматозоидов проводили в 500 мкл раствора Эрла в присутствии 2,5 мкг HindIII, KpnI-рестриктов плазмиды pRK3lacZ и 10 мкг кольцевой ДНК pRK3lacZ. В первом случае после 30 мин инкубирования суспензии клеток и ДНК при комнатной температуре были осеменены 3 самки: C1, C2 и C3. Во втором - к отмытым сперматозоидам сначала добавили DMSO до 1%, затем ДНК, после этого смесь проинкубировали в течение 10 мин, добавили DMSO до 3% и инкубировали еще 20 мин при комнатной температуре. Трансформированными спермиями обработали крольчих N C4-C6. В третьем случае после добавления DMSO до 1% и соответствующего количества ДНК, последующего инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре и повторного добавления DMSO до 3%, смесь охлаждали до 4^o C в течение 20 мин и затем нагревали до 42^o C за 2 мин. Трансформантами осеменили самок N C7-C12, часть из которых принесла потомство. Всего от крольчих N C1-C12 было получено 49 детенышей, из них 44 исследованы при помощи дот-гибридизации. В 32 (72,7%) случаях при гибридизации с зондом [³²P]-pRK3lacZ зарегистрирован положительный сигнал (см. табл. 1). В этих образцах обнаружено 0,1-1 пг искомой ДНК на 10 мкг хромосомной ДНК, что составляет менее 1 копии плазмиды pRK3lacZ на геном (~0,04-0,4). Зонд не гибридизовался с ДНК из контрольных животных (рис. 2).

Таблица 1. Итоги серии опытов N3.
Трансформация спермиев	Реципиент	Число крольчат
		рожденных	исследованных	с положительным сигналом
Естественная	C1	14	12 {N 1-12}	11
	C2	8	7 {N 13-19}	5
	C3	8	8 {N 20-27}	8
Всего		30	27 (100%)	24 (88,9%)
Искусственная	C5	1	1 {N 28}	1
	C11	14	14 {N 29-42}	6
	C12	4	2 {N 43-44}	1
Всего		19	17 (100%)	8 (47,1%)
Итого		49	44 (100%)	32 (72,7%)

Рис. 2. Дот-гибридизация зонда [32P]-pRK3lacZ с хромосомной ДНК. а1 - ДНК контрольного кролика; а2-а10 - разведения плазмиды pRK3lacZ (от 1 мкг до 0,01 пг); б1-г7 - ДНК полученных крольчат N 1-27.

Далее...