Научная Сеть >> Действие собственного антибиотика на продуцент имбрицина при выращивании на агаризованной среде

Наука >> Медицина | Научные статьи

Изучено действие собственного антибиотика имбрицина на продуцент Streptomyces imbricatus при выращивании на агаризованной среде. Выявлен высокий летальный эффект сравнительно низких концентраций антибиотика на культуру. На фоне отсутствия изменения морфолого-культуральных признаков у актиномицета под действием имбрицина обнаружено заметное увеличение изменчивости по признаку антибиотикообразования. При обработке штамма имбрицином в концентрации 200 мкг/мл выделен вариант, стабильно превышающий по антибиотической активности исходную культуру на 20%.

Ключевые слова:

Streptomyces imbricatus, имбрицин, антибиотикообразование.

В последнее время особое внимание уделяется группе неполиеновых противогрибковых антибиотиков [1]. Первый и наиболее характерный представитель этой группы антибиотиков - азаломицин F был описан еще в 1960 году (Япония). У нас в стране противогрибковый антибиотик со сходными физико-химическими и биологическими свойствами был выделен из культуральной жидкости Streptomyces imbricatus и назван имбрицином [2, 3].

Положительным свойством противогрибковых неполиенов, и в частности имбрицина, является низкая токсичность, что позволяет использовать его в пищевой промышленности в качестве фунгицидного наполнителя в полимерных пленках для защиты продуктов от плесневения. Также имбрицин предложен в качестве возможного биоцида для защиты целлюлозосодержащих материалов от микоповреждений [4].

Полиеновые антибиотики уже давно успешно используются в селекции культур-продуцентов. Так, под действием леворина и микогептина получено превышение активности селекционированного штамма над исходным на 25-27% [5]. Действие же неполиеновых макролидов изучено недостаточно. С продуцентом имбрицина такие работы ранее не проводились.

Целью настоящего исследования являлось изучение возможности использования имбрицина в качестве селективного фактора для получения высокопродуктивного стабильного варианта культуры-продуцента S.imbricatus.

Материал и методы

Объектом исследования служила культура актиномицета Streptomyces imbricatus штамм ЛИА 0112, полученная из Санкт-Петербургского НИИТИАФ.

Нефильтрованную суспензию продуцента в изотоническом растворе хлорида натрия, смытую с агарового косяка 7-суточного возраста, высевали на чашки Петри в соответствующих разведениях в количестве 0,1 мл на чашку. Использовали агаризованную среду N 21/12 с кукурузным экстрактом, солями и крахмалом [6], в которую добавляли имбрицин в таком количестве, чтобы концентрация антибиотика в среде составляла 100, 150, 200 и 250 мкг/мл.

Для первичного определения антибиотической активности моноспоровые варианты выращивали при температуре 28?С в течение 120 ч в колбах вместимостью 750 мл с 30 мл среды N 135 на качалках (n=220 мин^-1). Состав среды на 1 л водопроводной воды: глюкоза - 50 г, мука кукурузная - 40 г, соевая мука - 20 г, СаСО₃ - 1 г, рН до стерилизации 8,5.

Повторную проверку антибиотической активности отобранных вариантов проводили в две стадии. При этом культуру в течение 48 ч выращивали в колбах вместимостью 750 мл на посевной среде N 5 объемом 50 мл. Состав среды на 1 л водопроводной воды: соевая мука - 10 г, NaCl - 5 г, глюкоза - 10 г, СаСО₃ - 1 г, рН до стерилизации натуральный. Затем проводили засев колб с ферментационной средой из расчета 10% посевного материала от объема этой среды. Содержание имбрицина в культуральной жидкости определяли по УФ-спектру поглощения изопропанольных экстрактов на спектрофотометре СФ-36 при длинах волн 240 и 270 нм и рассчитывали по формуле:

A = (67,5*(D₂₄₀-D₂₇₀)P₁P₂) / 2,

где A - содержание антибиотика в культуральной жидкости, мкг/мл;

D₂₄₀ и D₂₇₀ - оптическая плотность спиртового раствора при длинах волн 240 и 270 нм соответственно;

67,5 - коэффициент пропорциональности, рассчитанный методом наименьших квадратов, зависимости между результатами спектрофотометрического и биологического анализов исследуемой пробы;

P₁ - разведение пробы при экстракции;

Р₂ - разведение пробы в этаноле;

2 - количество культуральной жидкости, взятой для анализа, мл.

Активность всех проверенных вариантов выражали в процентах от контроля. Для характеристики антибиотикообразования штамма использовали такие параметры, как среднее арифметическое (X) среднее квадратичное отклонение ( $\sigma$ ), коэффициент вариаций (Cv) и частота возникновения "плюс" и "минус" вариантов, определялась достоверность выборочной разности этих параметров, что математически выражалось X 2 $\sigma$ , а также критерием Стьюдента.

Результаты и обсуждение

В опытах нами была использована концентрация имбрицина в 10-25 раз меньше той, которая достигается в период максимального антибиотикообразования при глубинном культивировании продуцента. Однако культура S.imbricatus штамм ЛИА 0112 оказалась весьма чувствительной к собственному антибиотику при выращивании на агаризованной среде. Как видно из данных, представленных в таблице, выживаемость спор актиномицета с увеличением концентрации имбрицина резко падала. Доза 250 мкг/мл оказалась летальной, а при концентрации антибиотика в среде 200 мкг/мл процент выживших спор составил всего 0,76%. Также была отмечена задержка прорастания спор актиномицета от 3 до 6 суток в зависимости от концентрации антибиотика, добавленного к агаризованной среде.

Действие имбрицина на изменчивость продуцента S.imbricatus штамм ЛИА 0112

Концентрация имбрицина, мкг/мл Число просмотренных колоний Выживаемость, % Среднее арифметическое, X, % Среднеквадратичное отклонение, $\sigma$ , % Коэффициент вариаций, Cv, % Пределы колебаний активности, % к контролю Частота, %

"плюс"-варианты "минус"-варианты

100 26 98,7 97,7 3,9 20,08 20,5 60-160 20,0 7,8 11,5 6,2

150 26 29,9 96,2 3,3 16,90 17,6 60-140 7,7 5,2 3,8 3,7

200 13 0,76 120,8 2,9 20,15 16,7 80-180 84,6 10,0 0

250 - 0 - - - - - -

Контроль 30 100,0 94,7 1,8 9,9 10,5 60-120 0 0

Обработка культуры собственным антибиотиком не привела к изменению морфологических и культуральных признаков у актиномицета. Все просмотренные моноспоровые варианты устойчиво сохраняли первичные признаки исходного штамма. Описание колоний приведено на среде N 21/12 на 12-е сутки роста актиномицета при температуре 28 ?С. Колонии мелкие, диаметром 5-7 мм, хорошо приподнятые над агаром, бежевые (К-3) по шкале Бондарцева [7], шелушащиеся, край неровный, центр обозначен углублением, воздушный мицелий отсутствует, пигмент в среду не выделяется.

Из анализа данных, представленных в таблице, видно, что у вариантов, отобранных из обработанных имбрицином популяций, увеличиваются по сравнению с контролем значение среднего арифметического, коэффициент вариаций, увеличивается и достигает 180% по отношению к контролю размах изменчивости, появляются "плюс"- и "минус"-варианты. Причем с увеличением концентрации имбрицина в среде средне-арифметическое ряда возрастало (до 120,8% по отношению к контролю при содержании антибиотика 200 мкг/мл среды), в то время как коэффициент вариаций плавно уменьшался от 20,5% (доза 100 мкг/мл) до 16,7% (доза 200 мкг/мл) (см. табл.).

В качестве иллюстрации можно использовать также гистограммы, представленные на рисунке. Обращает на себя внимание гистограмма, полученная при дозе 200 мкг/мл. Здесь отмечается некоторый сдвиг модального класса вправо и появление справа двух новых классов. Критерий Стьюдента, рассчитанный для разности между средними активностями контроля и вариантов с дозы 200 мкг/мл, превышал значения по таблице на всех доверительных уровнях, то есть разница была достоверна.

Влияние имбрицина на изменчивость продуцента S.imbricatus по признаку антибиотикообразования.
По оси абсцисс - % к контролю; по оси ординат - % в популяции.
а - без имбрицина (контроль); на среде с имбрицином, мкг/мл: б - 100, в - 150, г - 200.

Отмечено появление "плюс"-вариантов во всех вариационных рядах, причем максимальное их количество (84,6 10,0%) получено при дозе 200 мкг/мл (см. табл.). "Минус"-варианты отмечались при дозах 100 и 150 мкг/мл и составляли соответственно 11,5 6,2% и 3,8 3,7%. Обработка культуры продуцента имбрицином в концентрации 200 мкг/мл оказалась оптимальной, так как здесь нами было выявлено наибольшее число "плюс"-вариантов при наименьшем значении коэффициента вариаций, что свидетельствует об одновременном селективном и стабилизирующем эффектах действия собственного антибиотика на актиномицет.

При повторных проверках вариантов, превышавших контроль более чем на 20%, повышенная активность была подтверждена для 10. Из них отобран вариант С9 (доза 200 мкг/мл), который превышал контроль на 20% на протяжении четырех генераций без дополнительного поддерживающего рассева.

Выводы

1. Изучено действие на культуру Streptomyces imbricatus штамм ЛИА 0112 собственного антибиотика имбрицина с целью поиска путей повышения антибиотической активности продуцента.

2. Культура актиномицета является чувствительной к действию собственного антибиотика при выращивании на агаризованной среде. Летальный эффект отмечался при дозах, в 10-25 раз меньших, чем максимальная концентрация, достигаемая при глубинном культивировании.

3. При обработке продуцента собственным антибиотиком имбрицином не было выявлено культурально-морфологических изменений в популяции. В то же время произошло заметное увеличение изменчивости штамма по признаку антибиотикообразования. Можно рекомендовать поддерживающий отбор культур на агаризованных средах, содержащих 150-200 мкг/мл имбрицина, с целью получения вариантов, заведомо превышающих контроль на 20-60%.

4. При обработке Streptomyces imbricatus ЛИА 0112 имбрицином в концентрации 200 мкг/мл выделен вариант С9, стабильно превышающий по антибиотической активности исходную культуру на 20%.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2000-N5, стр. 6-8.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шенин Ю.Д. Неполиеновые противогрибковые макролидные антибиотики. Антибиотики и химиотер 1991; 10: 50-54.

2. Кирсанова Р.В. Продуцент противогрибкового антибиотика Actinomyces sp. 212/5. Мат IV науч конф ЛНИИА. Л 1965; 69-70.

3. Цыганов В.А., Конев Ю.Е., Барашкова Н.П., Петрова Л.О. Образование антибиотиков типа азаломицина F культурой Actinomyces imbricatus sp. Антибиотики 1970; 3: 208-212.

4. Медведева Н.Г., Гриднева Ю.А., Сухаревич M.Э. и др. Влияние имбрицина на рост и физиологические признаки целлюлозоразрушающих микромицетов. Микол фитопатол 1996; 3: 43-47.

5. Жукова Р.А, Коммунарская А.Д., Пронина М.И. и др. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов. Л 1978; 160.

6. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М 1990; 240.

7. Бондарцев А.С. Шкала цветов. М 1954.

Антибиотики и химиотерапия

Написать комментарий