|
Проведено изучение роли транспортных функций плазматической мембраны клеток Acholeplasma laidlawii в формировании резистентности к ципрофлоксацину. Показано, что бромистый этидий, используемый как аналогичный фторхинолонам субстрат для эффлюксных насосов плазматической мембраны, значительно меньше накапливается резистентными к ципрофлоксацину штаммами. Установлено, что процесс выброса бромистого этидия зависит от температуры, трансмембранного электрохимического протонного потенциала и присутствия глюкозы в среде инкубации. Показано, что известные ингибиторы систем обратного транспорта, резерпин и верапамил, увеличивают степень накопления бромистого этидия, причем в значительно большей степени в случае устойчивого к ципрофлоксацину штамма. На основании полученных результатов можно утверждать, что у ахолеплазм существуют транспортные системы, осуществляющие активный выброс токсических веществ, причем у резистентных к ципрофлоксацину штаммов происходит индукция этих систем. Ключевые слова:
Микоплазмы (класс молликуты) - микроорганизмы, естественной средой обитания которых являются высшие растения, животные и человек. Патогенные представители молликут, паразитирующие в организме человека, в процессе эволюции приобрели ряд особенностей, позволяющих им ускользать от иммунологической защиты макроорганизма-хозяина и вызывать хронические персистирующие заболевания, нередко осложненные аутоиммунными расстройствами [1].
Основными отличиями микоплазм от других прокариотов являются отсутствие клеточной стенки, минимальный геном и редуцированный метаболизм. Так как клетка микоплазмы отделена от окружающей среды только плазматической мембраной, роль ее в метаболических процессах жизнедеятельности микроорганизма чрезвычайно велика [2].
Особенности строения микоплазм являются причиной неэффективности применения многих видов антибиотиков при лечении заболеваний, вызванных ими. Одним из перспективных и часто применяемых в настоящее время антибиотиков для лечения микоплазмозов являются фторхинолоны - синтетические антибактериальные препараты широкого спектра действия, эффективно применяемые против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Одной из проблем, связанной с использованием фторхинолонов, является спонтанное появление резистентных штаммов в процессе селекции микроорганизмов. Устойчивость к препаратам фторхинолонового ряда связана в большинстве случаев с точечными мутациями в определенных участках генов-мишеней ДНК-гиразы и топоизомеразы IV [3]. Кроме того, интенсивные исследования последних лет в этой области показали, что существенную роль в развитии резистентности к фторхинолонам играет понижение проницаемости плазмалеммы и активация процесса обратного транспорта - эффлюкса, приводящие к снижению уровня антибиотика внутри клетки [4]. Для некоторых грамположительных бактерий показано, что эффлюксные транспортеры, такие как Bmr [5], Blt [6] и Bmr3 [7] для Bacillus subtilis; NorA [8] для Staphylococcus aureus; LmrA [9] для Lactococcus lactis и LfrA [10] для Mycobacterium smegmatis, узнающие широкий спектр веществ, выбрасывают из клетки фторхинолоны и другие токсичные гидрофобные катионы, например, этидий [5]. Функции таких транспортеров могут специфично ингибироваться резерпином [11], а также протонофорами [12, 13].
В последние годы стали появляться работы, посвященные изучению резистентности микоплазм к фторхинолонам [14]. Однако все они в основном посвящены мутациям в генах ДНК-гиразы и топоизомеразы IV [15-17]. Особенности строения молликут позволяют предположить, что устойчивость к фторхинолонам во многом определяется метаболическими процессами плазматической мембраны. Изучение транспортных функций плазмаллемы, связанных с развитием резистентности у микоплазм, и явилось целью нашего исследования.
В работе использовали клетки Acholeplasma laidlawii, штамм PG-8В. Культивирование клеток проводили, как описано ранее [18].
За кинетикой роста культуры клеток в жидкой среде следили по изменению оптической плотности при 640 нм.
Число колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли как описано в [19].
Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) для препаратов устанавливали по методике, представленной ранее [2].
Резистентные штаммы получали путем селекции исходного дикого штамма при последовательном постепенном увеличении концентрации антибиотика в среде культивирования. В результате был получен штамм АС-10, растущий при концентрации ципрофлоксацина 10 мкг/мл, что значительно превышает МПК (0,2 мкг/мл) лабораторного штамма, а также ряд промежуточных штаммов, из которых в этой работе был использован штамм АС-0,25, растущий при концентрации ципрофлоксацина 0,25 мкг/мл.
За накоплением и выбросом бромистого этидия клетками ахолеплазмы следили по изменению флуоресценции этидия. Бромистый этидий в концентрации 0,5 мкг/мл вносили непосредственно в среду роста культуры клеток, находящейся в логарифмической фазе, после необходимой экспозиции клетки осаждали, ресуспендировали в буфере 50 мМ трис-HCl (рН 7,0) и измеряли увеличение флуоресценции этидия на спектрофлуориметре Hitachi, MPF 4000 (Япония), при длине волны возбуждения 530 нм и длине волны поглощения 660 нм. Для наблюдения выхода бромистого этидия суспензию клеток сначала выдерживали с бромистым этидием в течение часа, затем осаждали центрифугированием, осадок ресуспендировали в свежей среде культивирования. Об эффлюксе этидия судили по уменьшению флуоресценции осажденных клеток. Влияние резерпина (50 мкг/мл), карбонилцианидфенилгидразона (СССР) (0,2 мМ), верапамила (0,1 мМ), валиномицина (1,25 мкМ) и моненсина (1 мкМ) на уровень накопления бромистого этидия определяли аналогично, добавляя их непосредственно в среду культивирования, при этом используемые концентрации были меньше МПК этих веществ, определенных для A.laidlawii PG-8B.
Представленные экспериментальные данные являются усредненными по трем измерениям величинами, ошибка во всех случаях не превышала 5%.
Чувствительность к антибиотикам дикого и резистентного штаммов. В табл. 1 представлены МПК некоторых бактериальных препаратов, полученные нами для различных штаммов культуры клеток A.laidlawii, растущих в жидкой среде. МПК резистентного к ципрофлоксацину штамма АС-10 превысила МПК исходно чувствительного дикого штамма PG-8B в 100 раз. Перекрестная устойчивость штамма АС-10 к другим фторхинолонам (офлоксацину и ломефлоксацину) возросла в 20 и в 30 раз соответственно. При этом МПК некоторых других антибиотиков, применяемых для лечения микоплазменных инфекций, а именно тетрациклинов, канамицина, карбомицина и эритромицина, не изменились для штамма, резистентного к фторхинолонам.
| Таблица 1. Чувствительность дикого штамма A.laidlawii (PG-8B) и ципрофлоксацинорезистентного штамма (АС-10) к антибактериальным препаратам |
| Препарат |
МПK, мкг/мл |
| PG-8B |
AC-10 |
| Ципрофлоксацин |
0,2 |
20 |
| Офлоксацин |
3 |
70 |
| Ломефлоксацин |
7 |
200 |
| Тетрациклин |
0,2 |
0,1 |
| Доксициклин |
0,15 |
0,12 |
| Kанамицин |
20 |
15 |
| Kарбомицин |
0,2 |
0,3 |
| Эритромицин |
0,01 |
0,01 |
Культивирование дикого штамма A.laidlawii в присутствии 0,25 мкг/мл ципрофлоксацина (концентрации, несколько превышающей МПК) привело к ингибированию роста культуры клеток в жидкой среде (рис. 1А). Однако, как следует из данных по количеству КОЕ, представленных на рис. 1Б, клетки A.laidlawii обладают толерантностью к действию ципрофлоксацина, сохраняя жизнеспособность при действии препарата в концентрации, несколько превышающей МПК (кривая 2). Кривая скорости роста культуры клеток резистентного штамма АС-10 в жидкой среде в присутствии 10 мкг/мл ципрофлоксацина в целом не отличалась от кривой скорости роста дикого штамма (кривые 3 и 1 рис. 1А). В то же время для штамма АС-10 наблюдалось увеличение длительности латентной фазы в 2 раза и уменьшение максимума оптической плотности в стационарной фазе, при этом величина КОЕ для резистентного штамма в стационарной фазе роста на два порядка выше этого показателя для дикого штамма (рис. 1Б).
 |
Рис. 1. Влияние ципрофлоксацина на рост культуры A.laidlawii в жидкой среде.
А - изменения оптической плотности; Б - изменения титра клеток (в lg КОЕ) в процессе культивирования.
1 - дикий штамм PG-8B, растущий в стандартной среде инкубации; 2 - дикий штамм PG-8B, растущий в присутствии 0,25 мкг/мл ципрофлоксацина; 3 - ципрофлоксацино-резистентный штамм АС-10, растущий при 10 мкг/мл ципрофлоксацина. |
Накопление и выброс бромистого этидия. Бромистый этидий является субстратом для многих известных транспортных систем бактерий, осуществляющих активный выброс из клетки микроорганизма различных токсических веществ и антибиотиков, в том числе и фторхинолонов [5, 6, 8, 11]. Процесс накопления и выброса бромистого этидия клетками является удобной моделью для изучения возможного участия транспортных систем плазматической мембраны микоплазм в формировании резистентности к фторхинолонам. Полученные нами резистентные к ципрофлоксацину штаммы по-разному реагировали на ингибирующее действие бромистого этидия. Чувствительность штамма АС-0,25 к бромистому этидию уменьшалась в 2 раза по сравнению с диким штаммом (МПК - 1 мкг/мл), а для штамма АС-10 МПК не изменялась (данные не приведены). Аналогично селекции резистентных к ципрофлоксацину штаммов A.laidlawii была проведена и селекция штаммов, устойчивых к ингибирующему действию этидия, при постепенном увеличении концентрации бромистого этидия (от 0,5 до 3,5 мкг/мл) в среде инкубации. В результате для полученного штамма A.laidlawii, растущего при концентрации бромистого этидия 3,5 мкг/мл, наблюдалось увеличение МПК ципрофлоксацина в 2 раза по сравнению с диким штаммом. Наличие перекрестной устойчивости к ципрофлоксацину и бромистому этидию у штаммов ахолеплазмы позволило заключить, что в плазматической мембране клеток ахолеплазм существует транспортная система, ответственная за эффлюкс этих соединений.
В экспериментах по накоплению бромистого этидия клетками A.laidlawii использовалась концентрация этидия (0,5 мкг/мл), не вызывающая ингибирования роста культуры. Процессы накопления и выброса бромистого этидия клетками A.laidlawii протекают значительно медленнее при температуре 0 ?С (рис. 2). Отсутствие глюкозы, как источника энергии, в среде культивирования во время инкубации клеток микоплазмы с бромистым этидием не отразилось существенным образом на накоплении этидия клетками (рис. 3А), однако скорость эффлюкса при отсутствии глюкозы снизилась (рис. 3Б). Полученные результаты указывают на энергетическую зависимость процессов транспорта бромистого этидия клетками исследуемого микроорганизма. Из приведенных данных видно, что накопление бромистого этидия клетками микоплазм - довольно медленный процесс, насыщение достигается за 20-30 мин, тогда как для других микроорганизмов за 1-5 мин, но при этом скорость выброса значительно выше таковых величин, измеренных на других объектах [8, 20].
 |
Рис. 2. Влияние температуры на накопление (А) и выброс (Б) бромистого этидия клетками дикого штамма PG-8B.
1 - 37 ?C; 2 - 0 ?C. |
 |
Рис. 3. Зависимость накопления (А) и выброса (Б) бромистого этидия клетками дикого штамма PG-8B от присутствия глюкозы в среде инкубации.
1 - в присутствии глюкозы, 2 - без глюкозы. |
 |
Рис. 4. Кинетика накопления (А) и выброса (Б) бромистого этидия клетками различных штаммов A.laidlawii.
1 - дикий штамм PG-8B; 2 - ципрофлоксацинорезистентный штамм АС-0,25; 3 - ципрофлоксацинорезистентный штамм АС-10. |
На рис. 4 представлены результаты, позволяющие сравнить кинетику накопления (А) и выброса (Б) бромистого этидия клетками штаммов A.laidlawii, обладающими различной устойчивостью к ципрофлоксацину. Максимум накопления бромистого этидия резистентным штаммом АС-0,25 на 25% меньше максимума для дикого штамма, при этом скорость накопления также меньше. Более устойчивый штамм АС-10 накапливает этидия в 2 раза меньше, чем дикий штамм, на фоне более резкого выброса. При этом надо отметить, что резистентный штамм АС-10 при наличии ципрофлоксацина в среде инкубации накапливает бромистый этидий на 25% больше, чем при его отсутствии, что по-видимому является следствием конкуренции этих соединений за общий транспортер.
Далее...
Написать комментарий
|
