Фторхинолоны принято рассматривать как конкуренты цефалоспоринам в инфекционной клинике, в связи с чем становится, в частности, понятным интерес к созданию своеобразных пролекарств - конъюгатов между фторхинолонами и цефалоспоринами, которые по лабораторным данным могут проявлять более высокую антимикробную активность, чем эквимолярные смеси двух входящих в конъюгат компонентов. Что касается основных направлений структурно-функциональных исследований в области хинолонов, то их конечные цели в общем традиционны: получение путем направленной модификации веществ с измененным спектром антимикробного действия, измененной фармакокинетикой, повышенной активностью против микроорганизмов с приобретенной резистентностью к препаратам, долгое время применявшимся в клинике и т.д.

При всем этом механизм биологической активности фторхинолонов на молекулярном уровне продолжает во многом оставаться не раскрытым, несмотря на то, что подавляемый ими фундаментальный процесс жизнедеятельности - репликация ДНК является центральным или основополагающим в молекулярной биологии и поэтому глубоко и всесторонне изучаемым. Приходится считать, что все еще нет окончательно утвердившегося мнения о мишени для фторхинолонов. Представление о их непосредственном и исключительном реагировании с ДНК-гиразой, само по себе еще не дающее четкой картины ввиду сложности этого тетрамерного и многофункционального каталитического комплекса, было позднее подвергнуто частичному, но существенному пересмотру. Во-первых, оказалось не ясным, реагируют ли фторхинолоны с ферментным белком или его субстратом - участком ДНК, с которым вступает в контакт ДНК-гираза. Во-вторых, помимо ДНК-гиразы в качестве мишени для фторхинолонов привлек к себе внимание еще один фермент, участвующий в репликации - бактериальная ДНК топоизомераза IV [1, 2].

Медико-биологические и клинические данные, относящиеся к фторхинолонам разных поколений, результаты многих структурно-функциональных исследований, вопросы резистентности обобщены в двух изданиях широко известной монографии Е.Н. Падейской и В.П. Яковлева, а также обзорных статьях этих и других авторов, опубликованных в нашем журнале за последние годы. В данной статье в краткой форме рассматриваются современные представления о функциях топоизомераз типа II, т.е. ДНК-гиразы и топоизомеразы IV и молекулярных механизмах биологической активности хинолоновых структур.

Как известно, кольцевая хромосома бактерий (т.е. замкнутая молекула двуспиральной ДНК) находится в клетке в состоянии плотного сжатия - упаковки. У E.coli топология кольцевой молекулы ДНК, достигающей 1100 мкм длины, такова, что она укладывается внутри клетки, имеющей размеры 1-2 мкм. Релаксированная ДНК существует как спираль с одним полным поворотом витка спирали, приходящимся примерно на 10,4 пар оснований. Отсюда, в случае, например, E.coli, хромосома которой имеет 4 млн пар оснований, каждая из двух комплементарных нитей ДНК оборачивается вокруг другой приблизительно 400000 раз. Однако ДНК, изолированная из бактерий, имеет негативные супервитки. Это ведет к тому, что ДНК содержит на один виток меньше, чем 10,4 пар оснований [2]. Предполагается, что такое состояние ДНК в бактериальной клетке облегчает расцепление ее комплементарных нитей при репликации. Именно топоизомеразы играют решающую роль в том, что ДНК в клетке достигает необходимой степени суперскручивания в обоих реплицирующемся и не реплицирующемся участках хромосомы. Транскрипция многих генов, включая гены самих топоизомераз, очень чувствительна, как было показано, к показателю суперскручивания ДНК. Расцепление нитей в репликационном сайте резко меняет степень суперскручивания ДНК, и топоизомеразы являются ключевыми ферментами, которые регулируют сдвиг в степени суперскручивания впереди и позади репликативной вилки.

Первые работы с ДНК-гиразой, установившие связь с ней механизма действия хинолоновых структур, были проведены еще в 70-х годах с прототипами современных фторхинолонов - налидиксовой и оксолиниевой кислотами. ДНК-гираза имеет тетрамерную структуру (А2В2). Субъединицы А (97 кДа) и В (90 кДа) кодируются соответственно генами gyrA и gyrB. Эти структурные гены фермента, или ферментного комплекса, учитывая его сложность и несколько каталитических функций, не сцеплены и находятся в разных локусах хромосомы: у E.coli - 48-я (gyrA) и 83-я (gyrB) минуты. Введение негативных витков ДНК, катализируемое гиразой, происходит с использованием энергии АТФ.

За связывание с субстратом, т.е. участком ДНК, отвечает субъединица А. Двунитевой участок ДНК, контактирующий с гиразой, претерпевает временную ломку (разрыв) одной нити, что необходимо для введения негативного супервитка, с последующим воссоединением разорванной нити. В энергообеспечение, обусловленное гидролизом АТФ, включена субъединица В, с которой (ее N-терминальным участком) связывается АТФ (3). Следует отметить, что к настоящему времени установлены функционально различные домены, входящие в субъедииницу А: так, показано, например, что N-терминальная часть GyrA содержит остаток тирозина (Tyr-122), который включен в реакции ломки-воссоединения ДНК. В этом участвует его гидроксильная группа - происходит ее эстерификация 5'-фосфорильным концом расщепленного углеводно-фосфорного каркаса ДНК. Последовательность реакций ломки-воссоединения прослежена довольно подробно: показано, что при этом образуется связь между двумя А субъединицами в тетрамере [2].

Топоизомераза IV - вторая мишень для фторхинолонов, как это установлено в 90-х годах, "работает" координированно с ДНК-гиразой, принимая участие в общем процессе репликации ДНК. Подобно гиразе топоизомераза IV является тетрамером. Отмечена существенная гомология между ее генами parC и parE и генами гиразы (parC имеет гомологию с gyrA, parE с gyrB). Топоизомераза IV катализирует "декатенацию" - расцепление двух связанных нитей ДНК после репликации, т.е. отделение "дочерних" молекул ДНК [2, 4, 5].

ДНК-гираза работает впереди репликативной вилки, удаляя избыток позитивных супервитков, топоизомераза IV - позади.

В изолированном состояниии ДНК-гираза из E.coli оказалась более чувствительной к фторхинолонам, чем топоизомераза IV. С другой стороны, у S.aureus более чувствительна к фторхинолонам топоизомераза IV [1, 6]. Однако попытки, используя грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы, выявить здесь общую закономерность четкого результата не дали [7, 8].

Оба фермента (ферментных комплекса) казалось бы абсолютно необходимы для репликации, однако возможно, что механизм расцепления молекул ДНК после репликации имеет у некоторых микроорганизмов свои особенности. Так, сопоставляя относительную важность двух мишеней для антимикробного эффекта фторхинолонов, интересно отметить, что по крайней мере у трех видов организмов - Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori и Treponema pallidum, вторая мишень - топоизомераза IV отсутствует, судя по анализу их полностью секвенированного генома [9, 10, 11]. Причину этой особенности у некоторых видов предстоит изучать, в целом же если учитывать, что хромосома быстро размножающихся бактериальных клеток содержит множество репликативных вилок, согласованное действие гиразы и топоизомеразы IV представляется в процессе репликации принципиально важным.

Взаимодействие фторхинолонов с ДНК-гиразой in vivo быстрее прекращает синтез ДНК, чем взаимодействие с топоизомеразой IV. Это объясняется тем, что поскольку ДНК-гираза локализуется впереди репликативной вилки, то столкновение последней с остановившимся в движении ферментом (в тройном комплексе ингибитор - гираза - ДНК) происходит быстро; наоборот, топоизомераза IV, локализующаяся позади репликативной вилки, с последней не сталкивается в течение соответствующего цикла репликации [1].

Хотя недавно внесено много уточнений в молекулярные механизмы взаимодействия фторхинолонов с обоими ферментами, прямой информации о механизме реагирования ингибиторов с активными центрами ферментов еще мало. Вначале не было показано связывания меченого фторхинолона (норфлоксацин) с GyrA, GyrB и с холоферментом. В то же время было обнаружено, что метка связывается с ДНК. Позднее была продемонстрирована способность гиразы усиливать связывание хинолонов с двунитевой ДНК. Согласно одной из моделей молекула хинолона непосредственно связывается с однонитевым участком ДНК, создаваемым гиразой во время формирования комплекса. Хинолоны (предположительно) реагировали при этом с основанием ДНК за счет водородных связей, в образовании которых участвовали их 3-карбокси и 4-оксогруппа. Предполагалось кооперативное связывание четырех молекул ингибитора в желобе, создаваемом при действии гиразы на ДНК-субстрат. Далее эта модель развивалась в аспекте самоассоциации четырех молекул путем "складывания" ароматических колец и гидрофобных взаимодействий между N-1 заместителями. Согласно модели заместитель при С-7 фторхинолона реагирует с GyrB.

Однако позднее было показано, что меченый норфлоксацин не связывается ни с ферментом, ни с субстратом по отдельности. Связывание происходит только с комплексом гиразы и ДНК. Механизм же взаимодействия фторхинолонов именно и только с комплексом остается еще не достаточно ясным.

Хинолоны стабилизируют связывание топоизомераз типа II с ДНК и промотируют при этом конформационные изменения фермента и ДНК в комплексе. Это происходит перед разрывом ДНК и последний для комплексообразования не требуется. Места связывания фторхинолонов и ДНК с топоизомеразами - близки по расположению, хотя не исключено что хинолоны реагируют и непосредственно с ДНК, вызывая ее "дисторцию" и стабилизацию в таком состоянии в комплексе [1].

В результате формирования тройного комплекса хинолон - ДНК-гираза - ДНК прекращается не только репликация, но и транскрипция - блокируется движение РНК-полимеразы по матрице. В системе in vitro наблюдалось, таким образом, преждевременное прекращение транскрипции [1].

С другой стороны, способность хинолонов стабилизировать комплекс топоизомераз типа II с ДНК, т.е. ДНК-гиразы с ДНК и топоизомеразы IV с ДНК, формируя в каждом случае тройной комплекс (который при этом стабилизируется), объясняя прекращение синтеза ДНК, еще не объясняет причины появления разрывов в двунитевой ДНК, что принято связывать с летальностью, т.е. бактерицидным действием фторхинолонов. Возможно, что при формировании тройных комплексов - ингибитор-фермент- ДНК происходит индукция нуклеаз [3], что согласуется с тем фактом, что ингибитор транскрипции - рифампицин и ингибитор трансляции - хлорамфеникол снимают бактерицидность фторхинолонов [3].

Таким образом, непосредственный молекулярный механизм взаимодействия фторхинолонов с их мишенью, а также последовательность и природа наступающих после этого in vivo нарушений метаболизма, ведущих к гибели клетки, остаются далеко не ясными. Требуются дальнейшие генетические (работа с мутантными формами ферментов), кристаллографические и иные подходы и методы для точного установления места связывания хинолонов с ДНК-ферментным комплексом, знание при этом конформации фермента в комплексе, делающей возможной такую "посадку" ингибитора, установление последующих конформационных изменений комплекса. Требуется также выявление причин генерации однонитевых разрывов в двунитевой ДНК, наступающих после контакта фторхинолонов с бактериальной клеткой.

Наличие если не во всех, то в большинстве бактериальных видов двух мишеней для фторхинолонов с неодинаковой относительной чувствительностью к ним (зависящей от вида), а, с другой стороны, постоянное получение разных рядов фторхинолонов создают для работающих в этом направлении исследователей все более обширные задачи.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2000-N8, стр. 3-6.

ЛИТЕРАТУРА

2. Gootz T.D., Brightg K.E. Chemistry and mechanism of action of the quinolone antibacterials. In: The Quinolones, second edition. Ed. V.T. Andriole. Academic Press. San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto 1998; 29-80.

3. Сазыкин Ю.О., Навашин П.С. Антибиотики и оболочка бактериальной клетки. Итоги науки и техники. М: ВИНИТИ 1991; 31: 111-127.

4. Ferrero L., Cameron B., Manse B. et al. Cloning and primary structure of Staphylococcus aureus DNA topoisomerase IV: a primary target of fluoroquinolones. Mol. Microbiol. 1994; 13: 641-653.

5. Kato J., Nishimura Y., Imamura R. et al. New topoisomerase essential for chromosome segregation in E.coli. Cell 1990; 63: 393-404.

6. Blanche F., Cameron B., Bernard F.X. et al. Differential behaviors of Staphylococcus aureus and Escherichia coli type II DNA topoisomerases. Antimicrob. Agents Chemother 1996; 40: 2714-2720.

7. Pan X.C., Fisher L.M. Targeting of DNA gyrase in Streptococcus pneumoniae by sparfloxacin: selective targeting of gyrase or topoisomerase IV by quinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 1997; 41: 471-474.

8. Pan X.C., Fisher L.M. DNA gyrase and topoisomerase IV dual target of clinafloxacin in Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 1998; 42: 2810-2818.

9. Cole S.T., Brosch R., Parkhill T. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 1998; 393: 573-544.

10. Fraser C.M., Norris S.J., Weinstock G.M. et al. Complete genome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. Science 1998; 281: 375-388.

11. Tomb T.F., White O., Kerlavage A.R. et al. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 1997; 388: 539-547.