|
Виноградова К.А., Додзин М.Е. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
В начало...
(Продолжение)
Известно, что глутаминовая кислота является основным проводником нервного возбуждения в центральной нервной системе млекопитающих, и, таким образом, играет жизненно важную роль в динамических изменениях энергетического баланса мозга и протекании ряда нейро-физиологических процессов [37-39]. Такие образцы поведения, как визуальное обучение, ригидность мышц при воздействии морфина, модуляции диаметра зрачка, - являются глутамат-зависимыми явлениями [11]. С другой стороны, быстрое высвобождение глутаминовой кислоты, в частности при травмах мозга, в его экстрацеллюлярное пространство приводит к повреждению или гибели нейронов и к развитию различных неврологических заболеваний [37, 38]. Особое значение имеет разработка методов быстрого, прямого, in vivo определения уровня глутаминовой кислоты в ходе ее быстрого высвобождения в экстрацеллюлярную жидкость мозга для изучения таких заболеваний, как инфаркты, инсульты, эпилепсия и др. Ввиду большой важности данных исследований для медицины и нейрофизиологии, столь эффективный аналитический инструмент как L-глутаматоксидаза, в комбинации с методом микродиализа, была использована для создания новых биосенсорных систем для детекции экстрацеллюлярного глутамата мозга [12, 25, 37-39]. Такие методы оказались более надежными, быстрыми, простыми и удобными, чем использовавшиеся ранее в нейрофизиологических исследованиях [12, 25, 37, 38].
Основой новых биосенсорных систем для определения экстрацеллюлярного глутамата является микродиализный электрод, - устройство, комбинирующее глутаматоселективный амперометрический электрод и известную методику микродиализа (интрацеребральный диализ), применяющуюся для изучения состава диализных проб. Метод микродиализа позволяет изучать in vivo локальные изменения состава экстрацеллюлярной жидкости мозга. Микродиализные пробы в виде трубок из полунепроницаемой мембраны, соединенные с перфузионной системой, имплантируются в определенные области мозга лабораторного животного. В эксперименте исследуют in vivo динамические изменения концентрации глутамата в токе перфузата, происходящего из диализных проб, с использованием амперометрического Н2О2-чувствительного электрода.
Проблема помех, столь важная в исследованиях in vivo из-за присутствия в экстрацеллюлярной жидкости мозга физиологических концентраций эндогенных электроактивных веществ (аскорбиновой кислоты, допамина и др.), решается по-разному в разных биосенсорных системах: путем помещения на электрод пленки из 1,2-диаминобензола [39], путем иммобилизации фермента на платиновом электроде в слое поли-о-фенилендиамина [12, 37], иммобилизацией на поверхности электрода двух ферментов - L-глутаматоксидазы и L-аскорбатоксидазы и особым дизайном внутренней мембраны сенсора, состоящей из двух полимеров [38].
Созданные биосенсоры обладают всеми характеристиками, требуемыми для измерения концентрации глутамата в экстрацеллюлярной жидкости мозга - линейностью ответа в области физиологических концентраций глутамата, исключительной чувствительностью определения и высокой селективностью в присутствии физиологического уровня эндогенных электроактивных веществ в диализатах, и, что особенно важно для данных исследований, быстротой получения ответа - от менее 1 мин [12] до 1,3 сек [38].
Стратегия усовершенствования этих новых биосенсорных систем состоит в усовершенствовании метода микродиализа, уменьшении рабочей поверхности электрода, оптимизации расположения фермента на его поверхности и в общей миниатюризации электрода [38, 39]. Разработаны микробиосенсоры с диаметром электродов 25 и 10 мкм, что дает возможность размещать их в непосредственной близости к определенным структурам нейрона [37].
Проведены исследования в условиях in vivo с лабораторными животными и показана высокая эффективность разработанной биосенсорной системы для изучения динамики быстрого выброса глутамата в экстрацеллюлярное пространство мозга в условиях экспериментальных церебральной ишемии и остановки сердца [25, 39]. С помощью нового биосенсора осуществлена регистрация быстрых изменений концентрации экстрацеллюлярного глутамата in vivo в интактной центральной нервной системе крыс в условиях экспериментальной ишемии. Получены новые данные о функционировании определенных отделов мозга млекопитающих [38].
Предложенный методический подход - соединение интрацеребрального диализа с глутаматчувствительным биосенсором - рассматривается его авторами как будущее нейрофизиологических исследований. Была показана его высокая эффективность при исследовании быстрых динамических изменений в концентрации L-глутаминовой кислоты, происходящих в определенных условиях в экстрацеллюлярном пространстве центральной нервной системы. Этот метод был предложен как основной для изучения пространственного и физиологического аспектов роли L-глутаминовой кислоты в центральной нервной системе млекопитающих [38].
Уровень глутамина в крови является важным показателем при диагностике печеночной комы, острого панкреатита и ряда других заболеваний [18]. Быстрая детекция глутамина имеет большое значение для ряда биотехнологических процессов. В качестве одного из основных компонентов глутамин входит в состав питательных биотехнологических сред для культивирования клеток млекопитающих и насекомых, и контроль за его содержанием в среде в динамике развития культуры абсолютно необходим для поддержания нормального роста и развития клеток и оптимизации биосинтеза желаемого продукта [40, 41]. Кроме того, его детекция проводится при производстве различных фармацевтических препаратов, содержащих глутамин [42].
С открытием L-глутаматоксидазы были реализованы появившиеся возможности для разработки на основе глутаминазы и глутаматоксидазы новых биферментных сенсорных систем для детекции глугамина при проведении клинических анализов, для мониторинга состава сред непосредственно в процессе культивирования клеток, при определении содержания глутамина в фармацевтической продукции [5, 18, 21, 23, 35, 36, 40-44].
В биферментных биосенсорах определение глугамина происходит после его превращения в глутамат, по продуктам окислительного дезаминирования последнего.
После первых амперометрических биосенсоров на основе глутаматоксидазы и глутаминазы [36, 43], имевших ряд недостатков, связанных с относительно невысокой чувствительностью или с быстрой утратой первоначальной активности и др., усовершенствование их конструкции привело к появлению высокоэффективных сенсорных биферментных систем для прямой детекции глутамина. В одной из систем, в частности, не требуется раздельно определять глутамин и имеющийся в образце сыворотки крови эндогенный глутамат, благодаря использованию дополнительной мембраны с иммобилизованными глутаматоксидазой и каталазой [18]. Помехи от присутствующих в образцах сыворотки крови "эндогенных" аскорбиновой и мочевой кислот элиминируются специальным компенсирующим электродом. Чувствительность определения в этой разработке была по крайней мере в 200 раз выше, чем в предыдущих, границы линейного определения составляют 1x10-6-7,5x10-4 M. Через 95 дней работы сенсор сохраняет 80% первоначальной активности. Биосенсор был успешно апробирован для детекции глутамина в образцах сыворотки крови человека. Авторы предложили использовать метод в клинических лабораториях как универсальный, простой, легко автоматизируемый, обеспечивающий высокую специфичность и точность определения и имеющий относительно низкую стоимость [18].
Создана биферментная сенсорная система, адаптированная для определения глутамина в культурах клеток млекопитающих и насекомых, в частности в культурах гибридомных клеток мышей, образующих моноклональные антитела против антигенов красных кровяных клеток. Детекция ведется по образуемому пероксиду водорода, который определяется хемилюминесцентным методом в реакции с люминолом и феррицианидом [41]. Ее преимуществом является высокая чувствительность определения, что особенно важно для изучения лимитации роста клеток по глутамину при их культивировании. Границы линейного определения - от 1 до 100 мкМ [41]. В биосенсор введена колонка со специально подобранной йонообменной смолой, которая обеспечивает элиминирование помех от "эндогенного" глутамата, мочевой кислоты, ацетаминофена и др., содержащихся в образцах из культур клеток и могущих искажать получаемый ответ. Таким образом, введение в биосенсор этой колонки позволяет проводить прямое определение глутамина без раздельного определения его с глутаматом. Время проведения анализа от введения образца до получения ответа - 2 мин. Система не снижает уровня исходной активности при хранении в течение 2 месяцев при +4 ?С в буфере, обеспечивая проведение 500 анализов без потери первоначальной активности. Совпадение результатов определения данным способом и методом ВЭЖХ подтверждает его эффективность для детекции глутамина в культурах клеток млекопитающих и насекомых [41].
Проблема длительной и стабильной работы особенно важна для тех биосенсоров, которые должны быть использованы в ферментерах на объектах биотехнологической промышленности. Высокая стабильность работы сенсорной системы в условиях биотехнологического процесса была достигнута при использовании специальной полииминовой гелевой микроструктурированной мембраны для коиммобилизации ферментов [35]. Такая мембрана не только дает возможность оптимизировать количество иммобилизованного фермента для хорошей работы сенсора, но и осуществлять селективное подавление ответов от электроактивных "мешающих" веществ. С помощью такого биосенсора, включающего и проточно-инжекторную систему [35], ответ может быть получен через 45-60 сек. Область линейного определения - до 5 мМ. Сенсор был успешно использован для исследования нативной крови и плазмы, а также испытан в производственных условиях, будучи помещенным в пилотный биореактор, для мониторинга метаболизма гибридомных клеток. Он показал постоянную стабильную работу в течение 4 месяцев при постоянном использовании. Сообщается, что в настоящее время сенсор используется для мониторинга крупномасштабных ферментаций в промышленных биореакторах [35].
Далее...
Написать комментарий
|
